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漲知識(shí)|qPCR專(zhuān)場(chǎng)八：細(xì)節(jié)-認(rèn)真的態(tài)度和科學(xué)的精神

2023-10-7　　閱讀(254)

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漲知識(shí)|qPCR專(zhuān)場(chǎng)八：細(xì)節(jié)-認(rèn)真的態(tài)度和科學(xué)的精神

 


熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種檢測(cè)方法。該方法通過(guò)在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來(lái)記錄DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對(duì)PCR過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的，并且可以通過(guò)數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來(lái)源。

 

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)需要用心對(duì)待，各種細(xì)小的偏差都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確或難以理解的現(xiàn)象。小事成就大事，細(xì)節(jié)成就。接下來(lái)小翌給大家來(lái)介紹一下熒光定量PCR中需要注意的小細(xì)節(jié)。

 

 

 
RNA保證可用
 
RNA的完整度在很大程度上影響著cDNA合成的長(zhǎng)度與質(zhì)量。在進(jìn)行RNA提取、處理、儲(chǔ)存等實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要采取特殊的保護(hù)措施，如操作者佩戴手套和口罩，全程使用無(wú)RNA酶污染的實(shí)驗(yàn)耗材等；RNA存儲(chǔ)盡可能采用-80℃保存，且減少反復(fù)凍融。

RNA的完整性可通過(guò)Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行分析，其在分析RNA完整性之后能夠給出準(zhǔn)確的數(shù)值（RIN值，全稱(chēng) RNA Intesity Number），該值在8-10之間表示RNA質(zhì)量非常好，小于7時(shí)表示RNA完整度較差。

 

 

但是在多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中，一般不會(huì)有Agilent 2100生物分析儀。在這種情況下，我們可以采用一種最快速的方式檢測(cè)RNA完整性---凝膠電泳。進(jìn)行RNA凝膠電泳時(shí)，需要保證全程無(wú)核酸酶干擾的風(fēng)險(xiǎn)。電泳槽、配制瓶、制膠套件、電泳槽用DEPC水沖洗干凈，瓊脂糖和電泳液需要是新開(kāi)封的，從而保證RNA在上樣及電泳過(guò)程中不會(huì)被核酸酶降解。電泳時(shí)需要合理選擇電壓和電泳時(shí)間，電壓過(guò)高或長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)產(chǎn)生大量熱量，從而導(dǎo)致RNA降解。

 

▲高質(zhì)量的RNA電泳會(huì)有三條比較明顯的條帶，分別是28S，18S與5S核糖體RNA條帶，并且28S與18S的條帶亮度之比大體為2：1。當(dāng)RNA出現(xiàn)降解時(shí)，條帶會(huì)呈現(xiàn)彌散狀。

 

 

 
前期準(zhǔn)備穩(wěn)妥
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
01

實(shí)驗(yàn)儀器的準(zhǔn)備

常用的移液槍和進(jìn)行熒光定量PCR的qPCR儀器需要確認(rèn)定期有做過(guò)校正，通常校準(zhǔn)周期是一年，從而保證加樣的準(zhǔn)確性和檢測(cè)的準(zhǔn)確性。移液槍在使用之前用酒精擦拭槍桿并擦干放置一會(huì)兒，以減少污染的風(fēng)險(xiǎn)。

 

02

 

內(nèi)參基因的準(zhǔn)備

 

為了使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)所選基因進(jìn)行準(zhǔn)確且可重現(xiàn)的表達(dá)分析，使用可靠的內(nèi)參基因在實(shí)驗(yàn)之間標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平至關(guān)重要。GAPDH、β-actin和18S rRNA等是最為常見(jiàn)的內(nèi)參基因，但是無(wú)論選擇哪個(gè)基因作為內(nèi)源性對(duì)照，都必須對(duì)該基因進(jìn)行測(cè)試，以確保在所有所需的實(shí)驗(yàn)條件下基因的一致表達(dá)。

 

  • GAPDH不適合選作內(nèi)參的情況

    GAPDH基因是糖酵解中的關(guān)鍵基因，在代謝過(guò)程中的表達(dá)很容易受到多種因素的影響。如在細(xì)胞的增殖過(guò)程中，細(xì)胞需要的能量ATP增多，糖酵解代謝加大，GAPDH基因的表達(dá)水平很有可能被上調(diào)。有報(bào)道稱(chēng)，該基因可作為腫瘤發(fā)生的標(biāo)志物，在腫瘤組織與正常細(xì)胞及癌旁正常組織比較時(shí)，GAPDH表達(dá)并不一致。故在比較腫瘤組織與正常組織或細(xì)胞的某種基因或蛋白的表達(dá)時(shí)，GAPDH作為內(nèi)參應(yīng)慎重。

     

  • β-actin不適合選作內(nèi)參的情況

    對(duì)于actin蛋白由幾種異構(gòu)體組成，actin大致可以分為6種，不同actin之間具有較大的序列相似性(>90%)。在肌肉組織中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的組織都適合選β-actin作為內(nèi)參。例如當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，β-actin mRNA的表達(dá)水平增加；而假基因的存在也可干擾β-actin的檢測(cè)，此時(shí)并不適合選擇β-actin作為內(nèi)參。

     

  • 18S rRNA不適合選作內(nèi)參的情況

    rRNA的轉(zhuǎn)錄易受到各種生物因素和藥物的影響。在有絲分裂期間，28S、18S rRNA明顯減少或停止表達(dá)。此外存在很大爭(zhēng)議的是rRNA不包括poly(A)尾，在以oligo(dT)為引物的cDNA合成中不能被逆轉(zhuǎn)錄，建議在反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中除用oligo(dT)引物外，還要用18S作為反向引物，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA最好用RNA酶處理一下，再高溫滅活。

     

▲確定用于人胰腺器官組織 RT-qPCR 分析的最佳內(nèi)參基因(Cherubini, Alessandro et al. PloS one. 2021)
 
如何選用合適的內(nèi)參？
 
  • 通過(guò)查詢(xún)研究相同或類(lèi)似對(duì)象的文獻(xiàn)，獲取相關(guān)的內(nèi)參信息并測(cè)試；
     
  • 查詢(xún)實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因知識(shí)庫(kù)—ICG,獲取相關(guān)的內(nèi)參信息并測(cè)試；
     
  • 選擇實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)常用的內(nèi)參，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

     

03
靶標(biāo)基因引物的準(zhǔn)備
進(jìn)行引物設(shè)計(jì)后，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，選取擴(kuò)增效率在90%-110%(最佳95%-105%)之間，且熔解曲線(xiàn)為單峰的引物。

 

 

 
注重加樣細(xì)節(jié)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
01

加樣環(huán)境需保證

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的靈敏度很高，在配制預(yù)混液的時(shí)候需在超潔凈平臺(tái)中進(jìn)行，以防止外源的污染。一些預(yù)混液在室溫下是穩(wěn)定的，但最佳做法是將試劑成分、酶和樣品保存在冰上。另外在進(jìn)行染料法(SYBR)熒光定量實(shí)驗(yàn)時(shí), 需要避免強(qiáng)光照射，強(qiáng)光照設(shè)會(huì)導(dǎo)致SYBR淬滅。

 

02

試劑準(zhǔn)備需注意

不要渦旋震蕩含酶的混合物，因?yàn)槠鋵?duì)干擾高度敏感。僅輕輕旋轉(zhuǎn)或顛倒含酶的預(yù)混液即可。PCR引物和解凍的核酸可以通過(guò)輕輕且短暫的渦旋混合一到兩秒鐘。

 

03

加樣過(guò)程需謹(jǐn)慎

  • 加樣順序盡量選用先加大體積，后加小體積的方式；先加NTC，后加模板。加樣順序的把控可盡可能減少操作誤差和污染風(fēng)險(xiǎn)。
     
  • 槍頭勤更換，以減少交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。在重復(fù)組和樣品類(lèi)型之間需在每次吸取后更換槍頭。在加樣過(guò)程中，不要讓槍頭穿過(guò)其他孔或不同的樣品/檢測(cè)類(lèi)型。
     
  • 靈活使用移液槍?zhuān)M可能提升孔間重復(fù)和加樣精準(zhǔn)。針對(duì)10 μL及以下的小體積液體吸取，采用二檔吸取(按到底)，一檔排出(不按到底)。當(dāng)孔中有液體時(shí)，小體積液體加樣，需選用低吸附槍頭伸入至液面以下進(jìn)行排出，減少液體殘留在槍頭內(nèi)的現(xiàn)象。

     

04

密封、混合需全面

  • 加樣至96孔板前后，切勿使用記號(hào)筆等在板的表面或者板底部寫(xiě)字，這會(huì)干擾熒光激發(fā)和信號(hào)檢測(cè)。另外類(lèi)似墨水等物質(zhì)可能會(huì)在qPCR儀器中從板上轉(zhuǎn)移至儀器模塊上，這類(lèi)有色或熒光物質(zhì)污染模塊后會(huì)對(duì)當(dāng)前乃至后續(xù)的熒光定量PCR數(shù)據(jù)產(chǎn)生不利影響。用封板膜封板后，需檢查板的頂部以及驗(yàn)證是否與板良好接觸，尤其是邊緣部分。
     
  • 在正式上機(jī)前需對(duì)反應(yīng)組分充分離心混合，若混合不均勻，精準(zhǔn)度和效率可能會(huì)受到影響。另外需檢查孔中是否存在氣泡或黏附在孔壁上，若存在，需輕輕敲擊管子底部后短暫離心，從而消除溶液中的氣泡。

 

 

 
全面程序檢查
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 


除了根據(jù)說(shuō)明書(shū)仔細(xì)調(diào)整設(shè)置好反應(yīng)的溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)外，還需要注意以下事項(xiàng)：
  • 反應(yīng)體積是否填寫(xiě)正確---需按照實(shí)際反應(yīng)體積來(lái)進(jìn)行填寫(xiě)；
     
  • 延伸環(huán)節(jié)熒光采集開(kāi)關(guān)是否打開(kāi)---若熒光采集開(kāi)關(guān)未打開(kāi)，則會(huì)發(fā)生無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)的現(xiàn)象；
     
  • 熔解曲線(xiàn)程序不同儀器各不相同，上圖中僅以Abi Q5為例，通常選用儀器默認(rèn)的信號(hào)采集程序即可。

 

以上是對(duì)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中細(xì)節(jié)注意的介紹，相信小伙伴們通過(guò)小翌的介紹，今后會(huì)針對(duì)這些細(xì)小問(wèn)題已經(jīng)有一定的信心啦。關(guān)于如何做好qPCR實(shí)驗(yàn)，小翌本次給大家展示的是最終章啦，從專(zhuān)場(chǎng)一到專(zhuān)場(chǎng)八，小翌針對(duì)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題和困惑做了針對(duì)性介紹，希望能夠?qū)π』锇閭兊膶?shí)驗(yàn)有所幫助。當(dāng)然，還有很多知識(shí)，小翌還沒(méi)有介紹到，小伙伴們不要忘記自主學(xué)習(xí)哦！

 

 

 
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