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圖1.DNA甲基化示意圖
利用氧化酶（TET酶）、T4-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（T4-BGT）、脫氨酶（APOBEC酶）將未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），可更大程度地減少對(duì)DNA的損傷，最終產(chǎn)生的高質(zhì)量文庫(kù)。
圖2.酶法轉(zhuǎn)化-EM-seq的工作流程（Genome Res. 2021 Jun 17;31(7):1280-1289）
1、轉(zhuǎn)化效率高，樣本損傷??；
2、WGBS測(cè)序中，相對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，EM-seq有更高的文庫(kù)豐富度，可檢測(cè)到更多的 CpG位點(diǎn)；
3、可兼容cfDNA、FFPE DNA、單細(xì)胞DNA等樣本；
4、更少的樣本投入量，可獲得更高的數(shù)據(jù)質(zhì)量。
利用氧化酶（TET酶）將5mC和5hmC轉(zhuǎn)化為5-羧基胞嘧啶（5caC）， 吡啶硼將5caC轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，PCR擴(kuò)增后用于測(cè)序。
圖3.酶法轉(zhuǎn)化-Taps的工作流程（Nat Commun. 2021 Jan 27;12(1):618.）
1、破壞性更小、效率更高。
2、能保留樣本更多的原始信息，在DNA甲基化檢測(cè)中，可同時(shí)檢測(cè)基因突變和結(jié)構(gòu)變異。
3、可與多種下游分析技術(shù)兼容，包括但不限于甲基化敏感性PCR、限制性酶切、質(zhì)譜、全基因組測(cè)序等
TET/T4-BGT/APOBEC
TET/T4-BGT/APOBEC酶均未檢測(cè)出外切酶和切口酶殘留
圖4.TET酶外切酶和切口酶的殘留檢測(cè)
圖5.T4-BGT酶外切酶和切口酶的殘留檢測(cè)
圖6.APOBEC酶外切酶和切口酶的殘留檢測(cè)
TET/T4-BGT/APOBEC酶原料與對(duì)應(yīng)的緩沖液，cfDNA 以10ng和200ng的樣本起始量并參入1% λDNA和0.5%pUC19 DNA進(jìn)行甲基化轉(zhuǎn)化和甲基化建庫(kù)（12221ES），同時(shí)采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化作為對(duì)比（12222ES）, 結(jié)果顯示：TET/T4-BGT酶氧化效率≥99%，APOBEC酶的脫氨效率≥99%，轉(zhuǎn)化率與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化相當(dāng)，均能達(dá)到預(yù)期的效果。
圖7：TET/T4-BGT/APOBEC酶原料的功能檢測(cè)
采用3個(gè)批次的酶原料進(jìn)行功能檢測(cè)，TET/T4-BGT酶氧化效率以及APOBEC酶的脫氨效率均能達(dá)到99%以上,具有良好的批間穩(wěn)定性。
批次號(hào) | A批次 | B批次 | C批次 | |||
Input gDNA（ng） | 5 | 150 | 5 | 150 | 5 | 150 |
C convert（%） | 99.25 | 99.65 | 99.1 | 99.31 | 99.05 | 99.49 |
CpG methylated（%） | 1.20 | 0.60 | 1.30 | 0.17 | 0.49 | 0.54 |
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
Recombinant Ten-Eleven Translocase (TET) | 14554ES |
Recombinant APOBEC3A (A3A) Protein | 14553ES |
T4 Phage β-glucosyltransferase (T4-BGT) (10 U/μL) | 14551ES |
產(chǎn)品應(yīng)用 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
柱式-亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 | Hieff® DNA Bisulfite Conversion Kit | 12222ES |
磁珠法-亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 | Hieff® Mag DNA Methylation Bisulfite Kit | 12223ES |
甲基化建庫(kù) | Hieff NGS® Methyl-seq DNA library Prep kit for Illumina® V2 | 12221ES |
甲基化建庫(kù) | Hieff NGS® dsDNA Methyl Library Prep Kit for Illumina®雙鏈DNA甲基化建庫(kù)試劑盒 | 12214ES |
