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克隆技術(shù)，又稱為“生物放大技術(shù)"，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆"，即通過重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來(lái)，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
前兩期小翌給小伙伴們介紹了一些傳統(tǒng)的、應(yīng)用范圍廣的、新型的分子克隆方法。相信大家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大部分的分子克隆方法，諸如傳統(tǒng)分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無(wú)縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等等步驟，接下來(lái)小翌就具體解析一下載體和目的片段制備的過程，為您的實(shí)驗(yàn)提供好方法。
圖1.無(wú)縫克隆關(guān)鍵步驟
目的片段：目的片段來(lái)源為基因組DNA、另一質(zhì)粒的一部分或者線性DNA片段等。制備目的片段時(shí)常用的方法有兩種，方法一是通過PCR擴(kuò)增片段或者載體上的目的序列，在此過程中，如果制備目的片段是為了在下游進(jìn)行傳統(tǒng)的酶切酶連方式，就需要引入限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)與線性載體兩端相同的酶切位點(diǎn)，以便酶切后通過匹配的粘性末端進(jìn)行連接；如果制備目的片段是為了在下游進(jìn)行同源重組，則需要引入15-25 bp的上下游同源臂。
首先，通過翌圣的無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件 設(shè)計(jì)引物。輸入需要的載體序列和目的片段序列，選擇合適的酶切位點(diǎn)，生成引物，如圖2所示。
圖2.翌圣引物設(shè)計(jì)流程
值得注意的是，多個(gè)目的片段插入的雙酶切位點(diǎn)，實(shí)際添加到第一個(gè)片段的5’端和最后一個(gè)片段的3’端，中間片段不含有設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)。之后，通過引物合成公司合成需要的引物序列。接著，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段，如使用翌圣高保真PCR試劑盒（Cat#10164ES），包含高保真DNA聚合酶，擴(kuò)增目的片段快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)；或使用翌圣快速PCR試劑盒（Cat#10157ES），3 kb以內(nèi)基因組等復(fù)雜模板擴(kuò)增速度可達(dá)1-3 sec/kb，5 kb以內(nèi)質(zhì)粒等簡(jiǎn)單模板擴(kuò)增速度可達(dá)1 sec/kb，具有Taq DNA聚合酶，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物具有3’-dA突出端，可輕松克隆至T載體。
圖3. 10906ES連接2000 bp（50 ng）粘性末端片段圖
A：載體和片段均來(lái)自南京某高校；B：插入片段PCR鑒定電泳圖
擴(kuò)增后產(chǎn)物需要進(jìn)行純化。有兩種方法，一種是使用翌圣瓊脂糖（Cat#10208ES）配制凝膠，電泳后切割出目標(biāo)片段進(jìn)行純化，如使用翌圣的瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Cat#19101ES）能保證實(shí)驗(yàn)流程高效、結(jié)果可靠、得率高。另一種是直接取PCR產(chǎn)物純化，如使用翌圣PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Cat#19106ES），操作簡(jiǎn)便，15 min即可完成PCR產(chǎn)物純化。
載體：將目的DNA序列通過基因工程手段送到受體細(xì)胞所需的運(yùn)載工具。常見的載體有質(zhì)粒，病毒和噬菌體。當(dāng)前基因工程中的載體是質(zhì)粒。
所有基于質(zhì)粒的克隆載體包括：確保在細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)能有效增殖的復(fù)制原；單一酶切位點(diǎn)，或多克隆位點(diǎn)（MCS），后者含有一系列酶切位點(diǎn)，可供目的片段插入；載體成功轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌篩選標(biāo)記（例如，抗生素耐受）。
pET系列載體是目前應(yīng)用泛的重組蛋白表達(dá)載體，載體構(gòu)建時(shí)目的片段被克隆入載體噬菌體T7轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)下，經(jīng)轉(zhuǎn)化在宿主T7 RNA聚合酶的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。T7 RNA聚合酶具有并特異的啟動(dòng)T7啟動(dòng)子基因表達(dá)功能，當(dāng)其被誘導(dǎo)時(shí)，可使宿主本身的表達(dá)幾乎全部轉(zhuǎn)化為目的基因的表達(dá)，誘導(dǎo)幾個(gè)小時(shí)后即可使得最終目的基因表達(dá)產(chǎn)物超過細(xì)胞總蛋白的50%。
翌圣pET-28a(+) Vector表達(dá)載體（Cat#11905ES）載體帶有一個(gè)N端的His/Thrombin/T7蛋白標(biāo)簽，同時(shí)含有一個(gè)可以選擇的C端His標(biāo)簽，還有單一的多克隆位點(diǎn)，方便目的片段的克隆與表達(dá)，載體圖譜如圖4所示。
圖4. 翌圣pET-28a(+) Vector表達(dá)載體圖譜
準(zhǔn)備好載體后，即可進(jìn)行載體的制備。其與目的片段制備方法相同，可通過PCR擴(kuò)增或限制性內(nèi)切酶酶切獲得線性化載體。限制性內(nèi)切酶的選擇取決于載體和插入片段上是否存在相應(yīng)的識(shí)別序列、識(shí)別序列的位置以及是否適于連接。MCS往往是插入片段的，因?yàn)樵搮^(qū)域?qū)Ｓ糜诳寺 ?/span>
翌圣的FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶能快速、精準(zhǔn)完成DNA切割。載體酶切后，為防止自連，有必要進(jìn)行載體的去磷酸化，尤其當(dāng)載體酶切后末端可互補(bǔ)或是平端時(shí)。載體的去磷酸化對(duì)于降低背景、促進(jìn)所需片段插入載體非常重要，翌圣小牛腸堿性磷酸酶（Cat#10321ES）可將DNA、RNA的5’端磷酸基團(tuán)去除，有效阻止載體的自連現(xiàn)象。獲得的線性化載體也需要純化回收后使用。
圖5. 小牛腸堿性磷酸酶去DNA磷酸化示意圖
經(jīng)過上述步驟，載體和目的片段都已整裝待發(fā)，是時(shí)候開展下一步的載體和片段連接反應(yīng)了。那么連接反應(yīng)中應(yīng)用到的技術(shù)和試劑又有哪些呢？關(guān)注我們，小翌會(huì)在下一期的分子克隆技術(shù)專題中給大家具體講解分子克隆連接中應(yīng)用到的技術(shù)，為您的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)新的思路與方向，期待下一次的見面~
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 規(guī)格 |
5s/kb，高保真PCR（含上樣染料） | 2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) | 10164ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
快速PCR，快至1s/kb | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規(guī)PCR | 2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) | 10102ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
兼容TA/平末端克隆 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES08/20 | 5 T/20 T |
高質(zhì)量瓊脂糖 | Agarose瓊脂糖 | 10208ES60/76 | 100 g/500 g |
瓊脂糖凝膠回收試劑盒 | MolPure® Gel Extraction Kit 瓊脂糖凝膠回收試劑盒 | 19101ES50/70 | 50 T/200 T |
PCR產(chǎn)物純化試劑盒 | MolPure® PCR Purification Kit PCR產(chǎn)物純化試劑盒 | 19106ES50/70 | 50 T/200 T |
表達(dá)載體 | pET-28a(+) Vector 表達(dá)載體 | 11905ES03 | 1 μg |
去DNA磷酸化 | Alkaline Phosphatase(30 U/μl),Calf Intestine(CIAP) 小牛腸堿性磷酸酶 | 10321ES80 | 1000 U |
通用緩沖液，5min完成精準(zhǔn)酶切 | FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶 | 15001ES-15051ES | 50 T |
