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Taq DNA聚合酶的非特異擴增是PCR實驗中的常見問題，非特異擴增直接影響檢測結(jié)果的判讀并且會導(dǎo)致擴增靈敏度下降，甚至目標(biāo)片段的得率下降等。利用酶修飾劑在常溫下封閉Taq DNA聚合酶酶活中心，抑制常溫下Taq酶的DNA聚合酶活性，是目前抑制非特異性擴增的方式。翌圣開發(fā)的雙封閉抗體，不僅可以封閉Taq DNA聚合酶的聚合酶活性，還能同時封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增，又能防止物料降解產(chǎn)生非特異信號，雙重提升試劑特異性，使檢測試劑在運輸或室溫使用過程中都能夠從容應(yīng)對。
圖1.Yeasen雙封閉熱啟動Taq酶抗體產(chǎn)品
注：產(chǎn)品號 - CN202010666417.7
擴增特異性——雙封閉抗體可在低溫時同時封閉聚合酶和外切酶活性，能有效避免非特異性擴增，提高擴增特異性
檢測靈敏度——熱啟動形式增加了引物與微量的正確模板碰撞退火的效率，從而可保證低豐度基因有效檢出，靈敏度更高
優(yōu)秀產(chǎn)品穩(wěn)定性——37℃放置5天、4℃放置10天性能穩(wěn)定
基線平穩(wěn)線性好——解決了基線上漂問題，線性好
酶活釋放速度快——95℃下加熱20 s即可釋放95%以上酶活
酶類適用范圍廣——野生型和突變型Taq酶均適用，每mg抗體可封閉4-10 KU Taq酶（針對不同類型的Taq酶略有不同）
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Taq DNA聚合酶外切酶活性驗證
將合成的引物探針分別配于未封閉以及雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶的反應(yīng)液中，40℃反應(yīng)，檢測兩者熒光信號，發(fā)現(xiàn)雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。
圖2.雙封閉抗體外切酶活性封閉效率檢測
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檢測靈敏度驗證
分別用翌圣雙封閉抗體以及T公司抗體對Taq 酶封閉后通過ARMS-PCR技術(shù)檢測陽性樣本，發(fā)現(xiàn)翌圣雙封閉抗體封閉的Taq酶在ARMS-PCR擴增中分型準確，靈敏度更高。
圖3.ARMS-PCR擴增曲線圖
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穩(wěn)定性驗證（4℃-10天、37℃-5天）
用傳統(tǒng)封閉抗體與雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶，配置成含引物探針的全預(yù)混液，在4℃放置10天或在37℃放置1、3、5天，擴增10000拷貝ASF質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)擴增曲線和Ct值無明顯變化。
圖4.傳統(tǒng)封閉抗體（A）及翌圣雙封閉抗體（B）封閉的Taq酶，配成全預(yù)混的qPCR反應(yīng)液在4℃放置10天后擴增104拷貝ASF質(zhì)粒的擴增曲線圖
圖5.傳統(tǒng)封閉抗體（A）及翌圣雙封閉抗體（B）封閉的Taq酶，配成全預(yù)混的qPCR反應(yīng)液在37℃放置5天后擴增104拷貝ASF質(zhì)粒的擴增曲線圖
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基線檢測
某些引物配合特定buffer和儀器時，會出現(xiàn)基線上漂的情況，但雙封閉抗體能解決基線上漂問題，更有利于基線平穩(wěn)。
圖6.ASFV基因（A）、ACT基因(B)擴增曲線圖
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線性驗證
用雙封閉抗體封閉的反應(yīng)液擴增100000、10000、1000、100拷貝ASFV/ACT雙質(zhì)粒，制作標(biāo)準曲線。由圖7可以看到，兩者線性均良好。
圖7. 雙封閉反應(yīng)液制作ASFV基因、ACT基因標(biāo)準曲線圖
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酶活釋放檢測
分別用進口T公司抗體和翌圣雙封閉抗體（Cat#31303）封閉Taq酶，并在95℃下熱激20 s，檢測酶活?？梢钥吹?5℃熱激20 s后，31303可釋放95%以上的酶活，與T公司抗體相當(dāng)。
表1.95℃下熱激20 s酶活
產(chǎn)品類型 | 原酶 | 翌圣雙封閉抗體（95℃，20 s） | T公司抗體（95℃，20 s） |
酶活-U/μL | 2.15 | 2.1 | 2.2 |
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多類型Taq酶檢測
使用翌圣雙封閉抗體（Cat#31303）分別封閉三種類型Taq酶（1種野生型+2種突變型），封閉比例為1μg : 50U，通過熒光值定量法檢測封閉效率。結(jié)果顯示，對于不同類型的Taq酶，翌圣雙封閉抗體（Cat#31303）封閉效果均較好。
表2.不同類型Taq酶的封閉效率
產(chǎn)品類型 | 熒光值 | 封閉效率 |
空白 | 6461.74 | / |
原酶-Mut1 | 56221.33 | / |
原酶-Mut2 | 50819.64 | / |
原酶-Mut3 | 56466.33 | / |
31303-Mut1 | 7949.68 | 97.01% |
31303-Mut2 | 8267.35 | 95.93% |
31303-Mut3 | 8015.47 | 96.90% |
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小鼠基因組殘留檢驗
以水為模板作為陰性對照，小鼠基因組為模板作為陽性對照，擴增不同批次的31303，觀察條帶，發(fā)現(xiàn)樣品未擴增出目的片段，說明抗體不存在小鼠基因組殘留。
圖8 小鼠基因組殘留檢測圖
注：-為陰性對照，+為陽性對照，1-5為31303不同批次樣品
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
聚合酶與外切酶活性雙封閉抗體 | Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody Taq 酶單克隆抗體 | 31303ES |
聚合酶活性封閉抗體 | Hieff® anti-Taq DNA Polymerase Antibody Taq酶單克隆抗體 | 31301ES |
外切酶活性封閉抗體 | Hieff® anti-exonuclease of Taq Antibody Taq酶5'→3'外切酶單克隆抗體 | 31302ES |
