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不讓您寶貴的克隆留下“疤痕”！
提起傳統(tǒng)酶切連接克隆或載體構建，什么讓大家苦不堪言？
小A：每次都要糾結于各種限制性內切酶的選擇。 
小B：操作步驟繁瑣，耗時長，至少需三四天才能完成。
小C：每次只能克隆1個目的片段。
小D：片段結合位置上有時會留下“疤痕”。
······
忘記苦難，今天小編給大家介紹一種新的克隆方法—一步法同源重組技術，帶你們脫離苦惱！
一步法同源重組是一種利用同源重組的原理，進行無縫克隆的技術。該技術無需考慮酶切位點，幾乎適用于任何載體與任何片段的定向克隆。操作過程簡單快速，只需50℃，20min即可完成反應。勁爆的是，多個片段也可以同時克隆哦！
激動寶寶小C：如此厲害，是如何做到呢？
【秘】一步法同源重組的關鍵在于重組酶。它由三種酶混合而成。分別是外切酶，DNA聚合酶和連接酶。
外切酶活性：該酶能沿著5’→3’方向，降解雙鏈DNA，從而產生黏性末端，這樣便于與另外的同源末端進行配對結合（兩個同源序列通過外切酶的切割，能產生幾乎一致的黏性末端）。
DNA聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保證將每一個片段的5’末端都降解成一樣長的黏性末端，同源末端退火配對后，極可能存在缺失的堿基。此時需要借助DNA聚合酶進行修復缺口。
連接酶活性：催化形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補齊，實現無“疤痕”拼接，即無縫克隆。
好奇寶寶小D：外切酶降解雙鏈DNA多長呢？是否會把雙鏈DNA切割成單鏈導致無法進行片段重組呢？
莫擔心，自有妙招！的重組反應溫度是50℃，遠高于外切酶的zui適溫度（37℃），此外，外切酶的含量較低，故重組反應體系中很快會失去外切酶活性。對于200bp以上的雙鏈DNA-片段都是*不用擔心的，當然，幾十bp的小片段是不適合同源重組的。
心急寶寶小B：這么牛掰的，快給我們講講怎么操作吧。
步驟1：制備載體
需將線性化載體的制備好，既可以選擇酶切，也可以選擇PCR的方式制備線性化載體。
步驟2：設計目的片段引物
在目的片段上下游引物的5’端引入15-25bp左右載體末端同源序列。
步驟3：擴增目的片段
通過PCR的方法，使目的片段的兩端加上了與載體末端相應的同源序列。
步驟4：重組反應
按比例混合線性化載體和目的片段，50℃反應20 min。
步驟5：轉化，鑒定
將重組產物直接轉化后涂平板，挑取克隆進行陽性鑒定。
機智寶寶小A：有啥應用呢？
可以應用于定點突變，CRISPR，構建多順反子表達載體等等。
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