Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit ( flow cytometry) 

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測(cè)試劑盒（流式分析）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP），又稱線粒體巨型通道（magachannel），是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的非選擇性高導(dǎo)電性通道，由多種蛋白質(zhì)復(fù)合組成。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔 (mPTP)可能參與了細(xì)胞死亡過程中線粒體成分的釋放。

正常的細(xì)胞線粒體內(nèi)膜可維持正常的線粒體電位梯度以保證細(xì)胞呼吸作用及能量供應(yīng)，隨著Ca2+的攝入和釋放，一種低電導(dǎo)滲透性轉(zhuǎn)換孔在張開和閉合中來回切換。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)和病理性死亡時(shí)，線粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔滲透性發(fā)生改變，Ca2+的過載，線粒體谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后繼細(xì)胞色素C的釋放，線粒體膜電位下降等都會(huì)導(dǎo)致線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的激活。

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測(cè)試劑盒（流式分析）檢測(cè)方法是一種相對(duì)于僅基于線粒體膜電位分析更直接的檢測(cè)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放的檢測(cè)方法。其原理是：首先通過被動(dòng)運(yùn)輸加載Calcein AM，后者是一種對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，能夠輕易穿透活細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子 Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，使胞質(zhì)包括線粒體發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。加入CoCl2后，來自胞質(zhì)的熒光被CoCl2淬滅，僅留下線粒體內(nèi)的熒光。作為對(duì)照，可將細(xì)胞加載Calcein AM和CoCl2的同時(shí)，對(duì)其用離子霉素處理，從而使細(xì)胞加載更多的Ca2+，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的激活從而使線粒體熒光淬滅。

本試劑盒以1ml標(biāo)記體系計(jì)算，可供100次檢測(cè)。檢測(cè)zui大激發(fā)波長(zhǎng)494nm，zui大發(fā)射波長(zhǎng)517nm。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃避光干燥保存，避免反復(fù)凍融，有效期至少6個(gè)月。

注意事項(xiàng)

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

為了達(dá)到*實(shí)驗(yàn)效果，需針對(duì)不同的細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)條件等進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。本品還可配套其他探針一起操作。

1、 1mM Calcein AM儲(chǔ)存液制備

取出試劑并回溫至室溫，吸取50µl DMSO溶解1管Calcein AM，混勻后避光保存。

【注】：鈣黃綠素一旦溶解后，建議設(shè)置一系列實(shí)驗(yàn)將其短時(shí)間內(nèi)用完，不能長(zhǎng)期保存鈣黃綠素溶液。

2、 細(xì)胞染色（流式分析）

1）用本試劑盒含有的Cell Stain Buffer將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，使其密度為1×106細(xì)胞/ml。

【注】：① 用于離子霉素對(duì)照樣品的緩沖液必須含有Ca2+；

       ② 鈣黃綠素加載時(shí)不能含有血清；

       ③ 細(xì)胞必須為單細(xì)胞懸液。

2）按照1ml每管將細(xì)胞懸液等分，每個(gè)樣品等分成3份。

后續(xù)染色順序：1號(hào)管僅含鈣黃綠素，2號(hào)管含鈣黃綠素和CoCl2，3號(hào)管含鈣黃綠素，CoCl2和離子霉素，另外準(zhǔn)備一管不含試劑的細(xì)胞樣品用于相應(yīng)的儀器設(shè)置。

3）用Cell Stain Buffer 1:500稀釋1mM Calcein AM儲(chǔ)存液，制備成2µM的工作液，例如取5µl 1mM儲(chǔ)存液加入2.5ml Cell Stain Buffer，混勻即可。

4）向上述每個(gè)樣品的3管中分別加入5µl Calcein AM工作液并混勻。

5）向2號(hào)、3號(hào)管中加入5µl CoCl2，并混勻。

6）向3號(hào)管中加入5µl Ionomycin(100µM)，并混勻。

7）在37℃避光孵育15min。

8）向每管中加入3.5ml Cell Stain Buffer，離心收集細(xì)胞。

【注】：此步可去除多余染料以及可能引起熒光淬滅的試劑。

9）用400µl同時(shí)可用于流式檢測(cè)的合適的緩沖液重懸細(xì)胞團(tuán)。

如果需要，也可進(jìn)行進(jìn)一步染色。如用標(biāo)記的Annexin V 檢測(cè)磷酯酰絲氨酸易位；用PI 檢測(cè)細(xì)胞活力；或者用MitoTracker紅色探針檢測(cè)線粒體活力等。注意整個(gè)過程均需避光操作。

10）染色后，將樣品置于冰上，1h內(nèi)進(jìn)行流式分析。

11）用不含試劑的細(xì)胞樣品進(jìn)行相應(yīng)的儀器設(shè)置。用流式488激發(fā)器進(jìn)行熒光分析，Calcein AMzui大激發(fā)波長(zhǎng)494nm，zui大發(fā)射波長(zhǎng)517nm。

1號(hào)管-僅含鈣黃綠素：線粒體和胞漿有熒光，熒光信號(hào)較強(qiáng)；

2號(hào)管-含鈣黃綠素和CoCl2：僅線粒體呈現(xiàn)熒光，熒光強(qiáng)度居中；

3號(hào)管-含鈣黃綠素，CoCl2和離子霉素：線粒體和胞漿熒光均被淬滅，熒光信號(hào)zui弱。

2號(hào)管和3號(hào)管熒光信號(hào)的變化說明線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔被不斷的激活。

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