產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 檢測試劑盒（Annexin V-Alexa Fluor647/PI Apoptosis Detection Kit）是用Alexa Fluor647標記了的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發(fā)生，可用流式細胞儀或其他熒光檢測設(shè)備進行檢測。

其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被Alexa Fluor647 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

本試劑盒需要使用流式細胞儀進行檢測。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸。-20 ℃避光保存，避免反復(fù)凍融，一年有效期。

【注】：如果需要在短時間內(nèi)多次重復(fù)使用，可以在4 ℃避光保存，半年有效期。

注意事項

1、由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內(nèi)進行分析。

2、對于貼壁細胞，消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細胞誘導(dǎo)細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，PI攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠毎ど狭字＝z氨酸與Annexin V-Alexa Fluor647的結(jié)合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結(jié)合。

3、如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實驗結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

4、試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

5、Annexin V-Alexa Fluor647和PI是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光。

6、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

7、本產(chǎn)品僅作科研用途！

使用說明

1、 樣品染色

1.1、懸浮細胞：300 g，4℃離心5 min收集細胞。

貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。1.2、用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300g，4℃離心5 min。

1.3、吸棄PBS，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。

1.4、加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 647和10 μL PI，輕輕混勻。

1.5、避光、室溫反應(yīng)15 min。

1.6、加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，樣品在1小時內(nèi)用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

【注】：為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

2、流式細胞儀分析

Alexa Fluor647最大激發(fā)波長為651 nm，最大發(fā)射波長為667 nm；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），Alexa Fluor647為橫坐標，PI為縱坐標。每個樣采集10,000 events。

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