大鼠TGF-β1和bFGF的ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)研究

關(guān)于大鼠TGF-β1和bFGF的ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)研究方法：

1、建立膀胱出口部分梗阻(PBOO)模型：取30只3月齡雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，分籠飼養(yǎng)。分別為Sham組：8只，即假手術(shù)組；PBOO 2周組：11只，膀胱出口部分梗阻2周；PBOO 6周組：10只，膀胱出部分口梗阻6周。采用近端尿道結(jié)扎的方法建立Wistar大鼠PBOO模型。

2、模型成功后離體膀胱測重。

3、離體逼尿肌肌條收縮實(shí)驗(yàn)：分別于PBOO模型建立2周及6周后，斷頭處死 大鼠，Kerbs營養(yǎng)液下制作離體逼尿肌肌條(8×2 mm)，分別用濃度為10<'-5>mM、10<'-4>mM、10<'-3>mM、lO<'-2>mM的卡巴可(Carbamylmethylcholine，Carbachol)刺激 肌條，記零張力改變。張力改變經(jīng)拉力傳感器與四通道多功能生理信號放大器 相連、檢測信號輸入計算機(jī)并繪制曲線。結(jié)果經(jīng)MFlab軟件分析。采用單因 素方差分析檢驗(yàn)比較三組離體逼尿肌收縮功能。

4、RT-PCR方法測定逼尿肌中TGFβlmRNA、bFGFmRNA的表達(dá)：取Sham組、PBOO 2周組、PBOO 6周組共29例膀胱逼尿肌標(biāo)本，采用RT-PCR的 方法分別檢測逼尿肌TGFBlmRNA、bFGFmRNA的表達(dá)水平。用方差分析比 較各組間TGFBlmRNA、bFGFmRNA的表達(dá)差異，Spearman等級相關(guān)分析 二者mRNA表達(dá)水平與與逼尿肌收縮功能之間的關(guān)系。從RNA水平探討 BOO后膀胱逼尿肌中上述兩種生長因子的表達(dá)水平的變化。

5、用ELISA的方法測定三組大鼠尿液中TGFβ1、bFGF的表達(dá)水平：特制代謝 籠收集各組大鼠24h的尿液，采用ELISA方法測定各研究對象尿液中TGFβ1、bFGF的水平。采用方差分析比較各組結(jié)果的差異，Spearman等級相關(guān)分析 尿濃度水平與逼尿肌中相應(yīng)的mRNA表達(dá)水平之間的關(guān)系。

結(jié)果： 1、膀胱測重：Sham組、PBOO 2周組、PBOO 6周組的膀胱濕重依次為：100.5±9.0rag、196.6±19．4mg、410.8±25.2rag。PB002周組大于對照組，PBOO 6周組大于PBOO 2周組，三組相比較均有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2、Carbachol刺激下各組逼尿肌收縮功能：10<'-5>mM濃度Carbachol刺激下Sham組、PBOO 2周組、PBOO 6周組三組逼尿肌的zui大逼尿肌收縮力依次為0.23±0.04g、0.24±0.03g、0.19±0.02g。10<'-4>mM濃度Carbachol刺激下Sham組、PBOO 2周組、PBOO 6周組逼尿肌的zui大逼尿肌收縮力依次為0.85±0.18g、0.96±0.11g、0.65±0.06g。10<'-3>mM濃度Carbachol刺激下Sham組、PBOO 2周組、PBOO 6周組三組逼尿肌的zui大逼尿肌收縮力依次為1.82±0.19g、1.98±0.21g、1.12±0.08g。10<'-2>mM濃度Carbachol刺激下Sham組、PBOO 2周組、PBOO 6周組三組逼尿肌的zui大逼尿肌收縮力依次為2.12±0.26g、2.16±0.21g、1.40±0.19g。與Sham組相比，PBOO 2周組大鼠在上述指標(biāo)上高于Sham組，在Carbachol濃度10<'-4>、10<'-3>mM時兩組比較有顯著性差異(P<0.05)；在其濃度為10<'-5>、10<'-2>mM時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與Sham組相比，PBOO 6周組大鼠上述指標(biāo)均小于Sham組和PBOO 2周組組，且有顯著性差異(P<0.05)。

3、TGFBImRNA、bFGFmRNA在各組逼尿肌中的表達(dá)情況：TGFBlmRNA在 Sham組、PBOO 2周組、PBOO 6周組三組的表達(dá)依次為0.3212±0.01124、0.3426±0.0956、0.7236±0.2134，PBOO 2周組大于Sham組，但兩組無顯著性差異(P>0.05)；PBOO6周組大于PBOO2周組和Sham組，且統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)均有顯著性差異(P<0.005)。bFGFmRNA在Sham組、PBOO2周組、PBOO6周組的表達(dá)依次為0.1023±0.0526、0.2118±0.00656、0.3812±0.1269，PBOO2周組大于Sham組，PBOO 6周組大于PBOO 2周組。三者比較均有顯著性差異(P<0.05)。

4、尿液中TGFBl、bFGF的水平：Sham組、PBOO 2周組、PBOO6周組尿液中TGFB1表達(dá)依次為106.72±21.82μg/molCr、130.55±48.96μg/molCr、606.41±215.95μg/molCr，PBOO 2周組組高于Sham組組，但兩組之間無顯著性差異(P>0.05)；PBOO 6周組明顯高于PBOO 2周組，兩組之間比較00有顯著性差異(P<0.05)。bFGF在尿液中表達(dá)個體差異大，且表達(dá)水平很低，因此未作統(tǒng)計學(xué)分析。

5、相關(guān)性分析：離體逼尿肌收縮力(取各梯度濃度Carbachol刺激下收縮力的算術(shù)平均值)與其TGFB1mRNA、bFGFmRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析，與TGF61mRNA相比，Spearman等級相關(guān)性檢驗(yàn)n=21，r(等級相關(guān)系數(shù))=-0.4132，P<0.05，呈顯著中度負(fù)相關(guān)；與bFGFmRNA相比，Spearman等級相關(guān)性檢驗(yàn)n＝21，r(等級相關(guān)系數(shù))=—0.7022，P<0.05，呈顯著高度負(fù)相關(guān)。 逼尿肌TGFB1mRNA、bFGFmRNA表達(dá)水平與尿液中TGFB、bFGF濃度的相關(guān)性分析：Spearman等級相關(guān)性檢驗(yàn)逼尿肌TGFB1mRNA表達(dá)水平與尿液中TGFB1呈顯著中度正相關(guān)，n=21，(等級相關(guān)系數(shù))r=0.6632，P<0.05。由于尿液中bFGF表達(dá)陽性率低和個體表達(dá)水平變異大，未作相關(guān)性分析。

結(jié)論： 1、大鼠PBOO后膀胱濕重量逐漸增加，收縮功能在重度PBOO組明顯下降。 2、隨著大鼠PBOO的進(jìn)展，其膀胱逼尿肌bFGFmRNA表達(dá)水平持續(xù)升高。但是TGFB1mRNA在失代償階段表達(dá)才明顯升高。 3、尿液中TGFB1和逼尿肌中TGFB1mRNA表達(dá)呈中度正相關(guān)。 4、尿液中TGFB1在大鼠重度PB00時呈強(qiáng)表達(dá)，有可能成為一個預(yù)測BOO后膀胱逼尿肌的收縮功能和BOO解除后代償儲備能力的一個指標(biāo)。 5、TGFβ、bFGF均參與了BOO后膀胱逼尿肌功能障礙的病理生理進(jìn)程。應(yīng)用二者的單克隆抗體或者生長因子抑制劑治療BOO可能阻止或延緩該進(jìn)程的進(jìn)展。