大鼠細(xì)胞間粘附分子1檢測(cè)試劑盒使用報(bào)道：ICAM-1的作用

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細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）在腦缺血損傷炎癥過程中起著重要作用。腦缺血后ICAM-1和VCAM-1表達(dá)增加；ICAM-1、VCAM-1介導(dǎo)循環(huán)中的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，進(jìn)而浸潤(rùn)到血管外腦實(shí)質(zhì),導(dǎo)致缺血后炎癥；抑制ICAM-1、VCAM-1表達(dá)及作用可減輕腦缺血損傷。

放射性肺損傷（Radiation Pulmonary leision，RPL）是胸部腫瘤放射治療和骨髓移植全身照射預(yù)處理的常見嚴(yán)重并發(fā)癥和劑量限制因素，RPL屬于非感染性炎癥，一旦發(fā)生往往不可逆轉(zhuǎn)[1]，其發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，缺乏有效的預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療手段，成為胸部腫瘤得到有效治療的難題。細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是一重要的細(xì)胞間粘附分子和炎癥介質(zhì)，編號(hào)CD54，它參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)與活化，細(xì)胞的伸展、移動(dòng)、生長(zhǎng)、分化，炎癥、血栓的形成，腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合等一系列重要的生理和病理過程[2]。ICAM-1在RPL中通過介導(dǎo)多形核嗜中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear, PMN)等白細(xì)胞粘附、聚集于肺泡區(qū)域，是導(dǎo)致肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷及持續(xù)細(xì)胞因子釋放的關(guān)鍵因素，有報(bào)道表明抗ICAM-1抗體可以降低肺損傷的程度[3-4]，但目前關(guān)于ICAM-1在RPL中的具體作用機(jī)制及是否可以作為減輕放射性肺損傷的新靶點(diǎn)尚待進(jìn)一步研究。本文利用RNA干擾技術(shù)建立ICAM-1基因沉默細(xì)胞株以及應(yīng)用基因芯片技術(shù)具體從細(xì)胞與基因水平上分析其在RPL中的作用途徑及方式，為尋找防治RPL的有效措施提供理論依據(jù)和新思路。
　　 [目的]
　　 1.采用60Coγ射線照射建立小鼠放射性肺損傷模型，探討ICAM-1及相關(guān)因子在RPL中的表達(dá)變化。
　　 2.構(gòu)建ICAM-1基因沉默的小鼠肺腺癌細(xì)胞株(Lewis lung cell，LLC)，探討ICAM-1基因沉默前后LLC細(xì)胞的生物學(xué)特性及基因表達(dá)譜的變化。
　　 3.探討ICAM-1基因沉默對(duì)LLC細(xì)胞輻射敏感性的影響。
　　 [方法]
　　 1.采用照射劑量為16Gy的60Coγ射線全肺單次照射建立小鼠放射性肺損傷模型，HE染色法觀察小鼠肺組織損傷，免疫組化及Elisa法測(cè)定小鼠肺ICAM-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGFβ1)及腫瘤壞死因子-α（TNF-α)的表達(dá)變化。
　　 2.①針對(duì)ICAM-1mRNA序列，篩選、設(shè)計(jì)并合成shRNA相關(guān)基因片段，構(gòu)建3條高特異性的 shRNA表達(dá)載體pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA，采用酶切及DNA測(cè)序法驗(yàn)證插入序列的正確性。
　　 ②脂質(zhì)體法質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞，遺傳霉素G418抗性篩選獲得陽(yáng)性克隆。RT-PCR和Western blot法檢測(cè)shRNA對(duì)ICAM-1基因的沉默效率。
　　 ③應(yīng)用倒置顯微鏡觀察ICAM-1基因沉默前后細(xì)胞形態(tài)變化，繪制生長(zhǎng)曲線分析細(xì)胞生長(zhǎng)分裂差異，采用MTT比色分析法測(cè)定其增殖活性，基因芯片技術(shù)分析LLC細(xì)胞中ICAM-1基因下調(diào)后全基因組表達(dá)譜的變化，篩選可能與ICAM-1信號(hào)通路有關(guān)的差異基因，尋找ICAM-1信號(hào)通路的傳導(dǎo)過程以及其在肺癌細(xì)胞增殖、遷移調(diào)控中的可能分子機(jī)制。
　　 3.采用照射劑量為4Gy的60Coγ射線照射ICAM-1基因沉默LLC細(xì)胞株，MTT法檢測(cè)輻照對(duì)其增殖活力的影響，集落形成率試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)輻照敏感性的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)輻照對(duì)其細(xì)胞凋亡與周期的影響，探討ICAM-1在輻照后的小鼠肺腺癌LLC細(xì)胞株中的作用機(jī)制。
　　 [結(jié)果]
　　 1.與對(duì)照組比較，照射組的小鼠至照射后隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)有明顯脫落現(xiàn)象，肺呈充血水腫、不均質(zhì);肺泡壁增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯;肺組織中ICAM-1及其相關(guān)蛋白TGF-β1表達(dá)量明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，TNF-α表達(dá)量有所增加，但與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2.①經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建了3條靶向抑制小鼠ICAM-1基因及一條陰性對(duì)照的 shRNA真核表達(dá)載體pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA。
　　 ②成功篩選穩(wěn)定抑制ICAM-1表達(dá)的*性細(xì)胞克隆，RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)靶細(xì)胞在mRNA水平和蛋白水平上ICAM-1的抑制率分別為76.79％和79.01％(P＜0.01)。
　　 ③與對(duì)照組比較，ICAM-1基因沉默組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞生長(zhǎng)分裂周期延長(zhǎng);MTT結(jié)果顯示沉默組細(xì)胞增殖活性降低;基因芯片結(jié)果提示在沉默組LLC-ICAM1細(xì)胞與對(duì)照組LLC-NC細(xì)胞間共有290個(gè)存在明顯差異表達(dá)的基因，其中表達(dá)上調(diào)的基因有238個(gè)，下調(diào)的基因有52個(gè)。
　　 3.MTT及集落形成率試驗(yàn)結(jié)果表明ICAM-1基因沉默組對(duì)輻照的敏感度下降，在同等劑量的輻照條件下ICAM-1基因沉默組受到輻照后損傷程度降低，增殖活性及恢復(fù)能力均比對(duì)照組增強(qiáng);流式凋亡結(jié)果顯示ICAM-1基因沉默組細(xì)胞受到輻照后24h、48h細(xì)胞凋亡率均比對(duì)照組小，且48h后恢復(fù)情況也較對(duì)照組好，輻照24h后的細(xì)胞周期G2/M期比例明顯增加，48h后比例有所下降但仍比未輻照組高，提示與細(xì)胞凋亡結(jié)果相一致。
　　 [結(jié)論]
　　 1.在16Gy60Coγ射線照射建立的小鼠放射性肺損傷模型中研究發(fā)現(xiàn)，肺組織中ICAM-1蛋白存在異常表達(dá)，且與TGF-β1、TNF-α的表達(dá)變化相一致。提示ICAM-1的表達(dá)水平的高低可能與放射性肺損傷具有一定的相關(guān)性，且與TGF-β1、TNF-α等細(xì)胞因子存在相互作用，可作為預(yù)測(cè)或評(píng)價(jià)放射性肺損傷程度的一個(gè)重要因子。
　　 2.靶向 ICAM-1基因的重組質(zhì)粒載體pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA構(gòu)建成功，為建立ICAM-1基因沉默細(xì)胞株及后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 3.成功構(gòu)建ICAM-1基因沉默細(xì)胞株，沉默細(xì)胞株的生物特性研究提示ICAM-1可能參與細(xì)胞增殖等生理活動(dòng)。
　　 4.利用基因芯片技術(shù)分析ICAM-1基因沉默后全基因組表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)ICAM-1可能通過Bax/Bcl-2、FasL/Fas、MAPK等通路參與細(xì)胞增殖、凋亡等生理過程。
　　 5.在ICAM-1在照射后LLC細(xì)胞株中的作用機(jī)制研究試驗(yàn)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)干擾ICAM-1基因的表達(dá)，可以明顯降低LLC細(xì)胞株的輻射敏感性，增強(qiáng)輻射損傷后的恢復(fù)力。提示ICAM-1在放射性肺損傷中可作為基因治療潛在的分子靶點(diǎn)，為研究治療提供新的有效的治療策略。