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細(xì)胞

原代細(xì)胞

細(xì)胞系

供貨周期	現(xiàn)貨

PK15-cyclinA shRNA1豬腎上皮細(xì)胞系，PK15-cyclinA shRNA1 為 PK15 衍生細(xì)胞系，穩(wěn)定沉默 cyclinA（第 1 條 shRNA），上皮樣貼壁生長，增殖受抑，適用于細(xì)胞周期調(diào)控、病毒復(fù)制關(guān)聯(lián)研究及相關(guān)藥物篩選。

詳細(xì)介紹

PK15-cyclinA shRNA1豬腎上皮細(xì)胞系

PK15-cyclinA shRNA1豬腎上皮細(xì)胞系，PK15-cyclinA shRNA1 細(xì)胞系是通過 RNA 干擾技術(shù)靶向 cyclinA 基因第 1 條序列獲得的 PK15 衍生株，因?qū)?xì)胞周期蛋白 A（cyclinA）的沉默效率與功能表型有別于 shRNA2 亞型，成為細(xì)胞周期調(diào)控精細(xì)化研究、病毒復(fù)制周期依賴性對比分析的特色模型。其保留母系 PK15 細(xì)胞的上皮特性，同時(shí)通過特異性基因沉默呈現(xiàn)du特的細(xì)胞周期阻滯模式，為解析 cyclinA 不同功能域的作用、區(qū)分病毒對 cyclinA 依賴程度提供了精準(zhǔn)工具，與 shRNA2 亞型形成互補(bǔ)的研究體系。

一、細(xì)胞起源與生物學(xué)特性

來源與建立背景

PK15-cyclinA shRNA1 細(xì)胞系與 shRNA2 同期（2015 年）由我國學(xué)者構(gòu)建，靶向 cyclinA 基因的不同保守序列（“shRNA1" 對應(yīng)第 1 條干擾序列）。該細(xì)胞系因 cyclinA 表達(dá)量較母系下降 55%（低于 shRNA2 的 70%），且表型穩(wěn)定，2019 年被用于細(xì)胞周期調(diào)控的梯度效應(yīng)研究，解決了單一干擾效率難以解析基因劑量效應(yīng)的問題，成為首ge能模擬 cyclinA 中等程度下調(diào)的豬源細(xì)胞系。

形態(tài)與生長特征

細(xì)胞呈上皮樣形態(tài)，貼壁生長時(shí)呈多邊形，排列密度介于母系 PK15 與 shRNA2 之間，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核呈圓形（核質(zhì)比約 1:3.8），核仁清晰度優(yōu)于 shRNA2。在 37℃、5% CO?條件下，使用含 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基，倍增時(shí)間約 48-52 小時(shí)（長于母系的 36-40 小時(shí)，短于 shRNA2 的 60-64 小時(shí)），接種密度 2×10?個(gè) /mL 時(shí)，72 小時(shí)密度達(dá) 8×10?個(gè) /mL（為母系的 50%，高于 shRNA2 的 30%）。細(xì)胞凍存復(fù)蘇存活率超 88%，連續(xù)傳代 150 次后干擾效率波動＜6%，適合基因劑量效應(yīng)研究。

功能特性

細(xì)胞周期阻滯特征：流式細(xì)胞術(shù)顯示，G?/M 期細(xì)胞比例達(dá) 30%（母系 15%，shRNA2 為 45%），S 期比例降至 20%（母系 30%，shRNA2 為 10%），呈現(xiàn)中度 G?/M 期阻滯；cyclinB1 表達(dá)量代償性提升 25%（低于 shRNA2 的 40%），p21 等蛋白無顯著變化，證實(shí)阻滯程度與 cyclinA 表達(dá)量正相關(guān)。

增殖相關(guān)功能變化：Ki-67 陽性率降至 45%（母系 80%，shRNA2 為 25%），DNA 合成速率下降 40%（3H-TdR 摻入法，介于母系與 shRNA2 之間）；上皮標(biāo)志物 CK18 陽性率保持 96% 以上，確保上皮功能完整性。

病毒受體保留情況：豬細(xì)小病毒受體整合素 αvβ3（陽性率 93%）、豬圓環(huán)病毒受體硫酸乙酰肝素（陽性率 91%）表達(dá)量與母系及 shRNA2 相當(dāng)，為病毒感染的平行對比研究提供一致背景。

二、核心應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞周期調(diào)控的劑量效應(yīng)研究

cyclinA 功能梯度解析：通過與 shRNA2 對比，證實(shí) cyclinA 表達(dá)量與 G?/M 期阻滯程度呈線性相關(guān)（R2=0.92），且當(dāng) cyclinA 下降 50% 時(shí)，CDC25C 磷酸化水平下降 30%（shRNA2 為 50%），紡錘體異常率達(dá) 20%（shRNA2 為 35%），揭示 cyclinA 的劑量依賴性功能。

周期轉(zhuǎn)換動力學(xué)研究：采用活細(xì)胞成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系的 G?期時(shí)長較母系延長 6 小時(shí)（shRNA2 延長 12 小時(shí)），證實(shí) cyclinA 表達(dá)量與細(xì)胞周期進(jìn)程呈負(fù)相關(guān)，為解析周期調(diào)控的精細(xì)機(jī)制提供量化數(shù)據(jù)。

病毒復(fù)制的 cyclinA 依賴閾值研究

DNA 病毒敏感性差異：豬細(xì)小病毒在該細(xì)胞系中復(fù)制效率下降 35%（病毒滴度從母系的 10? TCID??/mL 降至 10?.? TCID??/mL，shRNA2 下降 60%），NS1 表達(dá)量下降 30%（shRNA2 為 50%），證實(shí)該病毒復(fù)制對 cyclinA 存在劑量依賴性需求，且存在 50% 的功能閾值。

病毒適應(yīng)機(jī)制對比：豬圓環(huán)病毒 2 型在該細(xì)胞系中復(fù)制效率下降 8%（shRNA2 下降 15%），其 Cap 蛋白與 cyclinB1 的結(jié)合能力較在 shRNA2 中弱 20%，揭示病毒代償機(jī)制的效率與 cyclinA 下調(diào)程度相關(guān)。

靶向藥物的梯度效應(yīng)評價(jià)

細(xì)胞周期藥物劑量篩選：建立基于梯度阻滯表型的篩選體系，發(fā)現(xiàn)某 cyclinA 抑制劑在 2μM 時(shí)可模擬該細(xì)胞系表型（G?/M 期 32%），5μM 時(shí)接近 shRNA2 表型，為藥物劑量優(yōu)化提供參考。

抗病du藥物的效能分級：利用該細(xì)胞系與 shRNA2 的梯度模型，發(fā)現(xiàn)某核苷類似物對豬細(xì)小病毒的抑制效果隨 cyclinA 下調(diào)程度增強(qiáng)而提升（EC??在母系中 1.2μM，該細(xì)胞系 0.8μM，shRNA2 中 0.4μM），證實(shí)藥物與細(xì)胞周期的協(xié)同作用。

三、培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)

基礎(chǔ)培養(yǎng)方案

培養(yǎng)基：同 shRNA2，采用含 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基，避免 EGF 等促增殖因子；為維持梯度表型，需與母系、shRNA2 同步培養(yǎng)，確保實(shí)驗(yàn)條件一致。

傳代流程：當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá) 65% 時(shí)，按 1:3 比例接種（介于母系 1:3-1:5 與 shRNA2 1:2 之間），離心速度 1000rpm，24 小時(shí)貼壁率超 92%，避免融合度＞75%（凋亡率較 shRNA2 低 5%）。

凍存保護(hù)：同 shRNA2，細(xì)胞密度 3×10?個(gè) /mL，復(fù)蘇存活率達(dá) 88%，需與 shRNA2 同時(shí)凍存以保證批次一致性。

功能實(shí)驗(yàn)操作

細(xì)胞周期檢測：流式細(xì)胞術(shù)分析時(shí)，需同時(shí)設(shè)置母系與 shRNA2 對照，G?/M 期比例變異系數(shù)＜6%；PH3 陽性率達(dá) 25%（母系 10%，shRNA2 40%），適合量化分析。

病毒感染實(shí)驗(yàn)：接種豬細(xì)小病毒（MOI=0.1）后 72 小時(shí)，病毒滴度檢測需采用三聯(lián)對照（母系、該細(xì)胞系、shRNA2），以明確 cyclinA 依賴程度。

四、優(yōu)勢與局限性

優(yōu)勢：

劑量效應(yīng)模型：填bu了 cyclinA 中等程度下調(diào)的研究空白，與 shRNA2 形成梯度模型，可解析基因功能的劑量依賴性（shRNA2 僅能模擬強(qiáng)抑制表型）。

表型穩(wěn)定性：干擾效率波動＜6%，且介于母系與 shRNA2 之間，適合精細(xì)化機(jī)制研究，不同實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)變異系數(shù)＜10%（shRNA2 為 8%）。

協(xié)同研究價(jià)值：與 shRNA2 聯(lián)合使用可構(gòu)建 “cyclinA 表達(dá)量 - 細(xì)胞周期 - 病毒復(fù)制" 的關(guān)聯(lián)曲線，為多變量分析提供du特工具。

局限性：

應(yīng)用范圍受限：僅適用于劑量效應(yīng)研究，單一使用時(shí)功能解析深度不及 shRNA2（強(qiáng)抑制表型更易觀察功能缺失）。

操作要求高：需與母系、shRNA2 同步實(shí)驗(yàn)，增加操作復(fù)雜度，且對培養(yǎng)條件一致性要求更高。

代償效應(yīng)差異：cyclinB1 代償程度較低，可能影響部分依賴 cyclinB1 的病毒研究（如豬圓環(huán)病毒 2 型）。

五、研究意義與展望

PK15-cyclinA shRNA1 細(xì)胞系的建立為細(xì)胞周期調(diào)控的量化研究提供了關(guān)鍵工具，其與 shRNA2 的梯度模型首ci證實(shí) cyclinA 對豬腎細(xì)胞周期的劑量依賴性調(diào)控。未來，通過構(gòu)建更多干擾效率的亞型，可繪制 cyclinA 功能的連續(xù)效應(yīng)曲線；結(jié)合 CRISPR-Cas9 技術(shù)實(shí)現(xiàn) cyclinA 的誘導(dǎo)性梯度表達(dá)，有望解析其在細(xì)胞分化、病毒感染不同階段的動態(tài)作用。作為基因編輯細(xì)胞系的梯度代表，該細(xì)胞系與 shRNA2 共同推動豬源細(xì)胞模型向精細(xì)化、系統(tǒng)化研究方向發(fā)展。

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