PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3 (PicoPLEX WGA v3)可以從單細胞擴增DNA，獲得高度可重復(fù)的文庫。細胞裂解和預(yù)擴增后，進行低背景的PCR擴增，并在3小時內(nèi)獲得微克級產(chǎn)物。
除了延續(xù)之前PicoPLEX WGA Kit可進行高度可重復(fù)的拷貝數(shù)變異（CNV）分析外，該試劑盒通過使用高保真酶，盡可能減少擴增誤差，并能檢測單核苷酸變異（SNV）。

圖1. PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3技術(shù)

表1 .使用PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3進行高質(zhì)量單核苷酸變異（SNV）檢測

以單細胞 (1cell) 和5個細胞 (5 cells) 的GM12878細胞系 (Coriell研究所) 起始 (一式兩份)，分別使用PicoPLEX WGA v3,A公司試劑盒和B公司試劑盒，以及bulk gDNA對照制備全基因組擴增產(chǎn)物，進行SNV檢測的比較。其中B公司試劑盒雖然制備了足夠的擴增產(chǎn)物，但只有5 cells樣本中一個包含足夠的擴增子進行測序，而其他樣本無可用數(shù)據(jù)進行測序。根據(jù)Genome In a Bottle (GIB) 和hg19 (human Genome assembly GRCh37, Ensembl) 數(shù)據(jù)庫的交叉分析，預(yù)計GM12879細胞系總共存在78個SNVs。由于擴增子的設(shè)計，2×75 bp的讀取長度很短，78個SNVs中的4個未能檢測到。因此，檢測的SNV總數(shù)減少到74個。使用VarDict軟件，以≥10reads (10X coverage) 和等位基因頻率≥20％為基準從BAM文件分析SNV。與其他兩個公司試劑盒相比，PicoPLEX WGA v3具有更高的call rates和更低的等位基因丟失率。

（數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.）

圖2. 基于PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3的CNV檢測

以來自不同細胞系(GM22601、GM05067和GM12878)的單細胞起始，使用PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3擴增基因組。之后取1ng的擴增產(chǎn)物，使用Illumina Nextera XT Kit制備文庫，并在Illumina MiSeq（PE 75）進行測序。對Fastq文件去除接頭序列信息后，與human genome assembly GRCh37進行比對。只分析常染色體。對于這兩個panels，校準歸一化至100萬reads，使用bedtools 2.25.0計算每1 Mb的 bin的reads數(shù)。使用Integrative Genomics Viewer (IGV)繪制bin counts的log2 ratio (Sample/Reference)。PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3還顯示了可以高品質(zhì)的進行染色體異倍性分析。

圖3. PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3的全基因組覆蓋范圍的重現(xiàn)性高

以GM12878的單細胞樣本起始（一式兩份），分別使用PicoPLEX WGA v3，A公司試劑盒和B公司試劑盒擴增基因組。之后取1ng的擴增產(chǎn)物，使用Illumina Nextera XT Kit制備文庫，并在MiSeq（PE 75）進行測序。然后與human genome assembly GRCh37進行比對，歸一化至1M reads (0.5M paired-end reads)后，使用bedtools 2.25.0計算每個1 Mb的bin的reads數(shù)。對這兩個單細胞文庫的每個窗口的total read進行繪制，計算Pearson和Spearman相關(guān)性并在每個圖中標明。

Panel A. 包含異常值的樣本。*由于不同技術(shù)存在不同的偏差，沒有排除相關(guān)點，所以圖表的比例不同。
Panel B. 排除異常值的樣本。與A公司和B公司試劑盒相比，PicoPLEX WGA v3具有更高的重現(xiàn)性和覆蓋度。

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