乙酰輔酶A含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。
規(guī)格：50T/48S 
產(chǎn)品內(nèi)容：
試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存。臨用前加入 500µL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：液體 20µL×1 支，4℃保存。臨用前加入 500µL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加入 45mL 試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑五：液體 60mL×1 瓶，4℃保存。
工作液的配制：臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.92 m L），將試劑二、三和四按照1:1:90的比例混合，或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻（可以測(cè)定48樣）；加樣前置37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴鍋中預(yù)熱30 min；現(xiàn)配現(xiàn)用；
產(chǎn)品說(shuō)明：
乙酰輔酶 A 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個(gè)樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)乙酰輔酶 A 匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過(guò)這條通路*氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于 ATP 合成。此外，乙酰輔酶 A 是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。
蘋(píng)果酸脫氫酶可催化蘋(píng)果酸和 NAD 生成草酰乙酸和 NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A。利用蘋(píng)果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應(yīng)，乙酰輔酶A 含量和NADH 的生成速率成正比，340nm 下吸光值的上升速率反應(yīng)了乙酰輔酶 A 含量的高低。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。操作步驟：
一、乙酰輔酶A 的提取
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

 二、測(cè)定步驟
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，用蒸餾水于 340nm 處調(diào)零。
2、取 920µL 工作液和 100µL 樣本至 1mL 石英比色皿，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 的吸光值 A1
和 80s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算?A=A2-A1。三、乙酰輔酶 A 含量計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 1640x + 0.012；x 為吸光值，y 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）。注意：本試劑盒比較低檢測(cè)限為 1.6nmol/mL。
1.按照蛋白濃度計(jì)算
乙酰輔酶 A 含量(nmol prot)=[(1640×?A＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×?A＋0.012) ÷Cpr
需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算
乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×?A＋0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×?A＋0.012) ÷W
(3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
乙酰輔酶 A 含量(nmol/104)=[(1640×?A＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×?A＋0.012)÷500
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。