ATP 含量試劑盒說(shuō)明書

ATP 含量試劑盒說(shuō)明書

測(cè)定意義：

ATP 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是生物能量通貨，能荷是描述細(xì)胞能量 代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測(cè)定 ATP 含量并且計(jì)算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。

測(cè)定原理：

ATP 在 254 nm 下有吸收峰，可以利用液相色譜法測(cè)定其含量。

需自備的實(shí)驗(yàn)用品：

液相色譜儀、低速離心機(jī)、溶劑抽濾裝置、針頭式過(guò)濾器（水系，50 個(gè)，0.22μm）、濾 膜（水系和有機(jī)系各 1 個(gè)，0.45μm）、C18 柱（4.6 ×150 mm）、可調(diào)式移液器、樣品瓶（50 個(gè)，2mL）、甲醇（色譜級(jí)，300 mL）和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 

試劑二：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑 1×1 瓶，粉劑 2×1 瓶，4℃保存；臨用前用少量蒸餾水將粉劑 1 和粉劑 2 溶解 后倒入 1000mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至 1000mL，形成流動(dòng)相緩沖液基質(zhì)（注：試劑瓶 中的粉劑要沖洗干凈）, 4℃可保存 1 周；

試劑四：ATP 標(biāo)準(zhǔn)品 5mg×1 支，-20℃保存。臨用前加入 1mL 蒸餾水，配成 5mg/mL 溶液， 配好后-20℃可保存 1 周.

實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：

1、將蒸餾水 1000 mL、流動(dòng)相緩沖液基質(zhì) 1000 mL 和甲醇 300 mL 用 0.45 μm 的濾膜抽濾， 以除去溶劑中的雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱。（注：蒸餾水和緩沖液基質(zhì)用水系濾膜抽濾，甲醇 用有機(jī)系濾膜抽濾）。

2、流動(dòng)相的配制：將抽濾完畢的流動(dòng)相緩沖液基質(zhì) 1000 mL 與甲醇配比為 99.9：0.1（v/v）， 即取 999mL 緩沖液基質(zhì)與 1mL 甲醇混合。

3、將抽濾完畢的甲醇和蒸餾水配比成 100%的甲醇， 10%的甲醇，蒸餾水各 250 mL。 將 2 和 3 中的溶劑超聲 30 分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱。

ATP 的提?。?/span>

1、組織的處理：準(zhǔn)確稱取組織重量 0.1g，加入 1mL 試劑一，提取 ATP， 4000g 常溫離心 15 min，取上清液，加入等體積的試劑二，混勻，4000 g 常溫離心 15 min，取上清，0.22μm 水系微孔濾膜過(guò)濾后冰上放置，待測(cè)。

2、細(xì)胞處理：收集約 30 mL 細(xì)胞，離心菌體經(jīng)干燥后，加入 1 mL 試劑一，超聲破壁細(xì)胞(950 W，30%，15 min，工作 1 s 間隔 2 s)，4000 g 常溫離心 15 min，取上清液，加入等體積的 試劑二，混勻，4000 g 常溫離心 15 min，取上清，0.22μm 水系微孔濾膜過(guò)濾后冰上放置， 待測(cè)。

ATP 含量測(cè)定操作步驟：

1. 開(kāi)啟電腦、檢測(cè)器和泵，安裝上色譜柱，打開(kāi) empower 軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量 20 μL，流速 1 mL/min，保留時(shí)間 10min，檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm,設(shè)置完畢保存方法組。 
2. 用100%的甲醇、10%的甲醇、蒸餾水按甲醇濃度從大到小的順序洗色譜柱 30min。 
3. 用流動(dòng)相洗柱子，待基線穩(wěn)定后開(kāi)始加樣。 
4. 加入標(biāo)準(zhǔn)品 20 μL，在 10min 內(nèi)可分離 ATP， ATP 的保留時(shí)間在 3min 左右，（柱子不同， 保留時(shí)間有差異），計(jì)算不同濃度的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。 
5. 加入樣品 20 μL，在相應(yīng)保留時(shí)間處檢測(cè) ATP 的峰面積。

ATP 含量的計(jì)算：

將5mg/ml 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水分別稀釋成 100 μg/ml、80 μg/ml、60 μg /ml、40 μg /ml和20 μg /ml 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)分別計(jì) 算 ATP 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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注：標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)要根據(jù)樣品中 ATP 濃度確定，樣品中 ATP 的峰面積必須落在不同濃 度的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積之內(nèi)，該標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)只是一個(gè)參考。