高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（ECL）使用方法

高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（ECL）

ECL Reagent是一種基于Luminol的高靈敏性、非放射性化學(xué)發(fā)光底物，用于檢測免疫印跡中固定在膜上的標(biāo)記有辣根過氧化物酶（HRP）的蛋白，可檢測pg級(jí)的抗原。Luminol在酶的催化作用下發(fā)生氧化降解，在增強(qiáng)劑的作用下發(fā)射波長為428nm的極-強(qiáng)的光信號(hào)，持續(xù)時(shí)間長、穩(wěn)定性高、檢測方便。

其原理是，蛋白質(zhì)或核酸電泳分離后轉(zhuǎn)印到膜上，以一抗及HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合膜上的目的蛋白，或以HRP標(biāo)記的探針直接或間接結(jié)合膜上的核酸。洗膜后用本產(chǎn)品配制的ECL工作液，在室溫下孵育膜1分鐘，將印記膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒中，然后暗室中將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘。顯影定影后蛋白質(zhì)或核酸條帶可清晰顯示在X光膠片上。也可不進(jìn)行X光膠片曝光，而直接對(duì)印記膜進(jìn)行熒光CCD掃描。光信號(hào)支持重復(fù)曝光，也可洗膜脫抗體后供再次檢測。

使用方法

1. 按常規(guī)方法完成SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)膜操作，將轉(zhuǎn)印好的膜從轉(zhuǎn)膜裝置上卸下來，并用封閉劑封閉膜上的非特異結(jié)合位點(diǎn)，室溫下?lián)u晃封閉1小時(shí)或2-8℃靜置封閉過夜。

  ※注意：封閉非常重要。

2. 棄封閉液，加入一抗工作液，室溫下?lián)u晃孵育1小時(shí)或2-8℃靜置孵育過夜。（抗體孵育濃度：一抗100～500ng／mL，二抗10～50ng／mL）。

3. 用洗膜緩沖液漂洗膜2次，然后用充分體積的洗膜緩沖液洗膜3-6次，每次5分鐘。

4. 用標(biāo)記HRP的二抗工作液室溫下孵育1小時(shí)。

5. 重復(fù)步驟3，*洗掉沒有結(jié)合的二抗。

6. 將試劑A和試劑B按1:1的比例混合成ECL工作液，根據(jù)每平方厘米膜使用0.1-0.2mL的量配制工作液，用ECL工作液充分覆蓋膜后室溫孵育1分鐘。

  ※注意：ECL工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫下放置不能超過1小時(shí)。

7. 用平頭鑷鉗住膜，垂直置于吸水紙上吸去過量試劑，將膜置于兩層保鮮膜之間，小心趕走膜與保鮮膜之間的氣泡。

8.  將膜吸附蛋白的面朝上置于暗盒中，于暗室中，取出膠片覆于膜表面，第一次曝光60秒，之后根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時(shí)間。

  ※注意：確保膜和保鮮膜上多余的液體已移除，曝光過程中要保持膠片干燥。

9. 取出膠片在顯影液和定影液中顯影。如果信號(hào)太強(qiáng)，減少曝光時(shí)間或脫掉抗體后降低抗體濃度重新孵育。

10. 在孵育后的初5-30分鐘內(nèi)發(fā)光*，發(fā)光長可持續(xù)數(shù)小時(shí)，但隨著時(shí)間的推移光信號(hào)減弱。

  ※注意：膜與膠片之間的移動(dòng)，將影響圖片效果，造成干擾。