細胞計數與存活的測試實驗方法

腫瘤細胞冷凍與復蘇是細胞培養(yǎng)的常規(guī)工作，可以解決細胞因為連續(xù)繼代造成的退變或轉化。細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)以及細胞凍存和復蘇后都需要細胞計數。那么細胞計數與存活的測試實驗方法有哪些呢？
1、原理：
（1）計算細胞數目可用血球計數盤或是Coultercounter粒子計數器自動計數。
（2）血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每ml中之細胞數目。
（3）存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypanblue染料，如果細胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。計算細胞活率：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%。計數應在臺盼蘭染色后數分鐘內完成，隨時間延長，部分活細胞也開始攝取染料；因為臺盼蘭對蛋白質有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數更為準確。
2、材料：
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)；Erythosinbluishstain；取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球計數盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip)；計數器(counter)；低倍倒立顯微鏡；粒子計數器(Coultercounter,CoulterElectronics)。腫瘤細胞稀釋液（4%乙酸溶液）。
3、步驟：
（1）取50μl細胞懸浮液與50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
（2）取少許混合液(約15μl)自血球計數盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosinbluish)。
（3）計數四個大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，zui后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
注：4大格細胞總數×稀釋倍數×104/4=細胞數/ml；每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml計數板計數時，zui適濃度為5～10×105細胞/ml，此范圍外計數誤差偏大。高濃度細胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數。
5、范例：
T75monolayerculture制成10ml細胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1mltrypanblue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數盤，計數四大方格內之細胞數目。
活細胞數/方格：55，62，49，59；死細胞數/方格：5，3，4，6；細胞總數=243
平均細胞數/方格=60.75；稀釋倍數=2；
細胞數/ml：60.75×104×2（稀釋倍數）=1.22×106；
腫瘤細胞數/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%