培養(yǎng)基的配制實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)步驟

組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，它是根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子和其他輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細(xì)胞外液相似。小牛血清含有一定的營(yíng)養(yǎng)成分，更重要的是它含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必須得生長(zhǎng)因子、激素、貼附因子等，這是合成培養(yǎng)基所無(wú)法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性。故一般體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)要加入一定量的小牛血清(10%-20%)。

實(shí)驗(yàn)步驟

(一) 準(zhǔn)備和安裝濾器

在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開(kāi)包有清洗滅菌好的過(guò)濾器的牛皮紙，并架好。膠管一段接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管伸入到已消毒的瓶子中。用濾泵做正壓過(guò)濾，壓力數(shù)字為2。過(guò)濾后檢查濾膜是否完好無(wú)損。

(二) 合成培養(yǎng)基的配制

1、 取3000ml三蒸水，加入合成培養(yǎng)基干粉，用磁力攪拌一定時(shí)間(2-4h)使之充分溶解。

2、 通入適量CO2 或加入6mol/L鹽酸調(diào)pH至6.0左右。

3、 加入一定量的NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0左右。

4、 加水至zui終體積。

5、 在超凈工作臺(tái)中對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌，分裝入250ml或500ml培養(yǎng)瓶中，用翻冒塞塞緊瓶口。

6、 4℃冰箱儲(chǔ)存(可以-20℃儲(chǔ)存)。

(三) 小牛血清的處理

市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還要做熱滅活處理，即通過(guò)加熱的方法破壞補(bǔ)體。

1、 將血清加熱到56℃并保存30min，期間要不時(shí)的輕輕搖晃，使受熱均勻，防止沉淀析出;

2、 處理后的血清儲(chǔ)存于4℃;

3、 小牛血清在使用前進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。

(四) 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制

除無(wú)血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需要加入一定量的小牛血清和抗生素。

1、培養(yǎng)基分裝成小瓶(100ml-200ml)以便使用，翻冒塞塞緊瓶蓋;

2、按以下比例配制：

基本培養(yǎng)基占80%-90%，小牛血清占10%-20%。

按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使用青霉素和鏈霉素的終濃度分別是100U/ml和100μg/ml。