人腸平滑肌細(xì)胞計數(shù)的操作步驟總結(jié)

人腸平滑肌細(xì)胞實驗原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

具體操作：

一.準(zhǔn)備工作：

取一瓶人腸平滑肌細(xì)胞，待長成單層后以被使用.

二.細(xì)胞懸液制備：

用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液(或hanks液或PBS等平衡鹽溶液)，吹打制成待測細(xì)胞懸液。

三.人腸平滑肌細(xì)胞計數(shù)：

1.取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上.

2.制備計數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍(lán)染液(0.4%)或苯胺黑?；罴?xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。

3.將細(xì)胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

4.統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。

5.計算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計算細(xì)胞密度：

細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)/ml=(四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)×2×104

說明：/4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù);×2因細(xì)胞懸液：染液=1：1稀釋;×104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm3 而 1ml=1000mm3

四.細(xì)胞計數(shù)要點：

1.進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)時，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中;

2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性。

3.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準(zhǔn)確;

4.數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時，只按照一個人腸平滑肌細(xì)胞計算。如果細(xì)胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。

5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。