新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)分散細胞培養(yǎng)

背根神經(jīng)節(jié)(DRG)干細胞起源于神經(jīng)嵴，NGF研究Levi-Montalcini的實驗表明，外原性NGF能刺激DRG細胞生長發(fā)育并形成廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在體外，分離培養(yǎng)的神經(jīng)節(jié)在NGF存在的情況下，神經(jīng)突起的生長在一天之內(nèi)可長達數(shù)毫米，因此，利用培養(yǎng)的DRG細胞，進行軸突生長發(fā)育的研究，是zui為經(jīng)典而常用的方法之一。

1、材料和方法

取新生一天的大鼠(wistar種)和小鼠(昆明種)。用眼科剪在無菌條件下除去背部皮膚, 然后剪取一段脊髓,背側(cè)朝上置于滅菌毛玻璃片上,在解剖顯微鏡下沿椎管兩側(cè)水平剪除腹側(cè)一半椎骨,暴露脊髓和神經(jīng)節(jié),用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)。雞胚背根神經(jīng)節(jié)的取材方法同前。 剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成0.2×105 個細胞/ml密度的細胞懸液，接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml干細胞懸液置。置標本于36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用飼養(yǎng)(Feeding)培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神經(jīng)細胞的增殖, 作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。

2、培養(yǎng)液成份

種植培養(yǎng)液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L);10%胎牛血清; 10%馬血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。

飼養(yǎng)培養(yǎng)液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,);5 % 馬血清; NGF 20ng/ml;神經(jīng)營養(yǎng)素 1ml/100ml;谷氨酰胺100μg/ml。

3、新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征

新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元接種后4h,大部分干細胞可貼壁, 呈圓形或橢圓形,直徑8-14μm, 胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈。神經(jīng)元的細胞核位于中央或偏于胞體一側(cè),核仁明顯,亦可見雙核神經(jīng)元。接種后24h, 大部分貼壁細胞開始長出突起。其中多數(shù)為具有多個突起的多極神經(jīng)元,少數(shù)為雙極和假單極神經(jīng)元, 突起細長,并可觀察到突起末端的生長錐。除單個散布的神經(jīng)元外,還常見到幾個或多個神經(jīng)元聚集在一起, 它們向四周發(fā)出樹枝狀的神經(jīng)突起。 培養(yǎng)2-3d后神經(jīng)元的突起逐漸增多并延長, 形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時間的延長, 神經(jīng)元突起的主干和分枝明顯延長并增粗,神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密, 神經(jīng)元胞體逐漸增大。大鼠背根節(jié)神經(jīng)元可維持培養(yǎng)2個月。