原生質(zhì)體分離

1. 原生質(zhì)體分離    
1.1 實(shí)驗(yàn)材料: 煙草無(wú)菌苗葉片，煙草懸浮細(xì)胞系。    
1.2 實(shí)驗(yàn)操作    
a. 取生長(zhǎng)3周的煙草無(wú)菌苗平展嫩葉，置于含有一薄層600mmol/L甘露醇-CPW溶液中，置于4℃黑暗下預(yù)處理6-8小時(shí)；    
b. 用吸管吸去預(yù)處理液，然后加入用CPW鹽溶液配制，經(jīng)過過濾滅菌的含有2％纖維素酶、0.4％離析酶、600mmol/L甘露醇的酶溶液，用封口膜將培養(yǎng)皿封嚴(yán)，置于暗處在24~26℃下保溫酶解16~18h；    
c. 在倒置顯微鏡下觀察，葉片細(xì)胞壁已降解，有圓球形原生質(zhì)體釋放到溶液中，即終止酶解。用吸管輕輕壓擠葉片，以釋放出全部原生質(zhì)體；    
d. 通過一個(gè)60~80μm的細(xì)胞篩過濾以除去較大的碎屑。濾液置于1個(gè)螺帽    離心管    中，在100g下離心3min，使原生質(zhì)體沉降；    
e. 棄取上清夜，將沉降物緩慢加入含有CPW配制的860mmol/L蔗糖溶液的螺帽    離心管    中，在在100g下離心10min；    
f. 將蔗糖溶液的頂部綠色原生質(zhì)體帶收集起來(lái)，并轉(zhuǎn)入到另一個(gè)離心管中。在離心管中加入原生質(zhì)體培養(yǎng)基以使原生質(zhì)體懸浮，在100g下離心3min，重復(fù)本相清洗過程至少3次；    
g. zui后一次清洗之后，加入培養(yǎng)基調(diào)整原生質(zhì)體密度至0.5×105到1×105/ml。將原生質(zhì)體按講授的方法培養(yǎng)。    
附CPW配方：    
KNO3
101mg/L
MgSO4·7H2O
246mg/L
KH2PO4
27.2mg/L
KI
0.16mg/L
CuSO4·5H2O
0.025mg/L
CaCl2·2H2O
1.48mg/L