1. 原代細(xì)胞凍存復(fù)蘇技術(shù)簡介
在ELISPOT檢測(cè)的應(yīng)用中，往往需要用到凍存的淋巴細(xì)胞樣品作為檢測(cè)細(xì)胞。由于ELISPOT檢測(cè)的是細(xì)胞的免疫功能，不僅僅需要保持細(xì)胞的存活率，而且還要保證細(xì)胞的功能不發(fā)生變化。傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法通常是為了保存細(xì)胞株，對(duì)細(xì)胞存活率的要求不高，更沒考慮保持細(xì)胞原有的免疫狀態(tài)，所以傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法已經(jīng)不能滿足ELISPOT檢測(cè)的要求。參見圖7.1。
考慮到ELISPOT檢測(cè)的特殊性，荷蘭U-CyTech公司經(jīng)過精心的研究與反復(fù)的驗(yàn)證，推出了Cryostar™凍存試劑盒，在凍存液中添加了一系列對(duì)細(xì)胞有特殊保護(hù)作用的保護(hù)劑。達(dá)科為公司在接到Cryostar™凍存試劑盒之后，在我們的實(shí)驗(yàn)室以及國內(nèi)數(shù)家客戶的實(shí)驗(yàn)室做了細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)，并且對(duì)復(fù)蘇之后的細(xì)胞做了ELISPOT檢測(cè)。結(jié)果表明，淋巴細(xì)胞的存活率超過90%，ELISPOT斑點(diǎn)形成頻率與新鮮細(xì)胞*相同。
2. 細(xì)胞凍存、復(fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)程序
l 實(shí)驗(yàn)儀器：
    ² 可控溫度細(xì)胞離心機(jī)離心機(jī)；
    ² 血球計(jì)數(shù)板或者自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備； 
    ² 細(xì)胞程序降溫盒Nalgene “Mr. Frosty”；
    ² -70°C冰箱；
    ² 液氮罐；
    ² 37°C水浴鍋。
l 耗材準(zhǔn)備
    ² 15ml圓錐底聚丙烯（PP）離心管； 
    ² 無菌的原代細(xì)胞凍存管，2ml，外螺旋；
l 試劑配制
    ² 熱失活補(bǔ)體胎牛血清； 
    ² R0培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，加入1%雙抗，不加血清。
    ² 達(dá)優(yōu)®無血清培養(yǎng)基：已經(jīng)含有谷氨酰胺和雙抗，打開即用。
    ² Cryostar™重懸液(Cryostar™ Resuspension Medium)：含有細(xì)胞凍存保護(hù)成分，-20°C長期保存，4°C可以保存6個(gè)月。
    ² Cryostar™ 2×凍存液（Cryostar™ Freezing Medium）：含有原代細(xì)胞凍存保護(hù)成分以及DMSO，-20°C長期保存，4°C可以保存6個(gè)月。