原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟

原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)需要注意以下幾點(diǎn)：

1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3

2、細(xì)胞密度大約占培養(yǎng)板的80%左右，轉(zhuǎn)染。

3、轉(zhuǎn)染期間不要加抗生素，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

步驟如下：以24孔培養(yǎng)板為例

1、轉(zhuǎn)染前一天細(xì)胞換新的培養(yǎng)基

2、制備DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物，如下:

a、用50ul無血清培養(yǎng)基稀釋DNA（0.8g），輕輕混勻；

b、Lipofectamine 2000使用前，輕輕混勻，用48ul無血清培養(yǎng)基稀釋2ul Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；

c、將a+b的液體加在一起，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物形成；

3、將100ul DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物加入培養(yǎng)板中，輕輕前后搖勻；

4、放入37度孵箱中培養(yǎng)24~48h后，1：10傳代，加入G418篩選。加入G418的量設(shè)幾個(gè)梯度或者轉(zhuǎn)染前做MTT，找好G418對(duì)你所轉(zhuǎn)細(xì)胞致死量的濃度。

5、等細(xì)胞在G418作用下，長(zhǎng)滿后凍存幾支（保種）。再克隆化培養(yǎng)：將細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，加入22ml*培養(yǎng)基中，混勻，分裝在96孔板中（200ul/孔）。第二天在顯微鏡下，尋找孔中有單個(gè)細(xì)胞的孔并做標(biāo)記，等做標(biāo)記的孔長(zhǎng)滿后，消化、轉(zhuǎn)移到4孔或6孔培養(yǎng)板中，zui后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，凍存，鑒定。

6、原代細(xì)胞鑒定成功后，建議馬上做后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過程或凍存中，轉(zhuǎn)進(jìn)去的基因容易從細(xì)胞中掉下來。
HPLC法含量測(cè)定    100mg    100784-200701    美他多辛
HPLC法有關(guān)物質(zhì)檢查    50mg    100785-200701    D-焦谷氨酸
檢查用    50mg    100786-200501    托拉塞米雜質(zhì)
含量測(cè)定用    50mg    100787-200501    奈達(dá)鉑
檢查用    100mg    100788-200501    3-吲哚甲酸
檢查用    100mg    100788-200501    鹽酸托烷司瓊雜質(zhì)
HPLC法含量測(cè)定    100mg    100789-200501    塞曲司特
HPLC法含量測(cè)定    100mg    100790-200501    氫溴酸西酞普蘭
HPLC法含量測(cè)定    100mg    100791-200501    利拉萘酯
原代細(xì)胞