小動物活體成像技術(shù)（in vivo imaging technology）是利用高靈敏度的光學(xué)檢測儀器直接檢測動物活體體內(nèi)的細(xì)胞活動和基因行為研究的一類技術(shù)，是近年來發(fā)展最快的生命科學(xué)研究方法，是最直接觀察細(xì)胞和分子在體內(nèi)行為的新興技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域[1]。

活體動物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光與熒光發(fā)光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是利用熒光素酶報(bào)告基因在活體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的熒光蛋白與體外注射的熒光素底物發(fā)生化學(xué)反映產(chǎn)生熒光。而熒光發(fā)光成像技術(shù)是將熒光物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記的小分子物質(zhì)如基因、細(xì)胞也可是小分子藥物、抗體、納米材料等導(dǎo)入到活體體內(nèi)，通過小動物活體成像系統(tǒng)的激發(fā)光源激發(fā)熒光集團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生波長較激發(fā)光長的發(fā)射光，然后通過高靈敏度制冷CCD鏡頭探測到活體內(nèi)的發(fā)射光。通過活體成像技術(shù)可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生、特定基因的表達(dá)和藥物作用效果等生物學(xué)過程。

本期小愛主要為大家介紹小動物活體成像實(shí)驗(yàn)中常用的熒光染料及文獻(xiàn)研究思路！

一、D-熒光素   abs42017256

D-熒光素是螢光素酶的底物，在鎂離子存在下熒光素酶使熒光素與ATP反應(yīng)，發(fā)出黃綠色的光?？膳c小動物活體成像系統(tǒng)配套使用，用于體內(nèi)活體熒光檢測。

應(yīng)用案例：子宮內(nèi)膜癌腹膜轉(zhuǎn)移異種移植模型的研究[2]

首先構(gòu)建含IL-37BΔ1-45或NC的CV146/熒光素酶慢病毒載體，感染篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞（ISK-LV-IL37b、Δ1-45和ISK-LV-NC）。然后將穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞腹腔注射到小鼠體內(nèi)建立子宮內(nèi)膜癌腹膜轉(zhuǎn)移模型。

飼養(yǎng)38天后，對所有小鼠腹腔注射底物D-熒光素（abs42017256）。10分鐘后，小鼠腹腔注射0.3% Sodium Pentobarbital溶液。5分鐘后，使用體內(nèi)成像系統(tǒng)光譜對小鼠進(jìn)行體內(nèi)生物發(fā)光成像（圖1）。然后處死小鼠，取出器官（肝、肺和腎）進(jìn)行成像。取部分腫瘤及上述臟器用福爾馬林固定，石蠟包埋，其余冰凍于?80°C進(jìn)行HE染色、免疫組化染色、免疫印跡。

圖1  IL-37b抑制子宮內(nèi)膜癌腹膜轉(zhuǎn)移異種移植瘤模型的研究[2]（abs42017256 D-熒光素）

二、DiR 碘化物   abs45153692

DiR 碘化物是一種親脂性的熒光染料，經(jīng)常用來染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。由于DiR的近紅外熒光可以穿透細(xì)胞和組織，因此在小動物活體成像技術(shù)中也經(jīng)常使用。

應(yīng)用案例：用DiR標(biāo)記納米膠束，評價(jià)膠束的腫瘤靶向性以阻止缺氧腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移[3]

采用薄膜分散法制備殼寡糖（COS）包被、唾液酸（SA）受體靶向的順鉑（CDDP）和一氧化氮（NO）共載體納米膠束（CTP/CDDP），并用DiR標(biāo)記膠束，然后利用體內(nèi)成像系統(tǒng)評價(jià)CTP/CDDP/DiR的腫瘤靶向性。如圖2a所示，游離DiR在注射后經(jīng)歷了快速的藥物代謝和血液循環(huán)清除，在腫瘤內(nèi)幾乎檢測不到其熒光信號。DiR標(biāo)記的CTP/CDDP膠束給藥后3h，腫瘤組織內(nèi)可見明顯的熒光，且熒光強(qiáng)度隨時間延長而增強(qiáng)。

具有智能靶向性的CTP/CDDP膠束增加了細(xì)胞對CDDP的攝取，增強(qiáng)了對腫瘤的細(xì)胞毒性，但降低了對正常器官或組織的全身毒性。在抗腫瘤機(jī)制方面，CTP/CDDP通過下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α、谷胱甘肽2、多藥耐藥相關(guān)蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，減少順鉑外流，抑制腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而逆轉(zhuǎn)缺氧腫瘤細(xì)胞的耐藥和轉(zhuǎn)移。

圖2 DiR標(biāo)記抗腫瘤納米膠束在小鼠體內(nèi)示蹤腫瘤組織[3]（abs45153692 DiR 碘化物）

此外，用于生物標(biāo)記的Cyanine 7.5（一種發(fā)近紅外熒光的花青素?zé)晒馊玖希┯捎谄錈晒獠ㄩL很長，發(fā)射峰（Em max）大于 800nm，恰好處于肌體組織近紅外窗口I的區(qū)域（肌體的血液，體液和組織此區(qū)域背景熒光弱，而長波長穿透性強(qiáng)），所以Cy7.5的標(biāo)記物也常應(yīng)用于小動物活體體內(nèi)成像。

[1] Ntziachristos V. Going deeper than microscopy：the optical imaging frontier in biology[J]. Nature Methods，2010,7(8):603-614.

[2] Wang X, Wei Z, Tang Z, et al. IL-37bΔ1-45 suppresses the migration and invasion of endometrial cancer cells by targeting the Rac1/NF-κB/MMP2 signal pathway[J]. Laboratory Investigation [2023-06-12]. DOI:10.1038/s41374-021-00544-2.

[3] Chen Y, Fang L, Zhou W, et al. Nitric oxide-releasing micelles with intelligent targeting for enhanced anti-tumor effect of cisplatin in hypoxia.[J].Journal of Nanobiotechnology, 2021(1).DOI:10.1186/S12951-021-00989-Z.

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