背景介紹

糖代謝是細(xì)胞能量合成的主要方式，是維持機(jī)體生命活動的基礎(chǔ)。在氧氣充足的環(huán)境中，正常細(xì)胞通過葡萄糖氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation，OXPHOS)途徑產(chǎn)能，1mol葡萄糖氧化后可生成36mol ATP。在無氧環(huán)境下，葡萄糖經(jīng)無氧糖酵解代謝轉(zhuǎn)化為乳酸，1mol葡萄糖僅能產(chǎn)生2mol ATP。1927年Warburg先發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞相比其他細(xì)胞具有更高的葡萄糖攝取率及增強(qiáng)的糖酵解反應(yīng)為腫瘤細(xì)胞增殖提供主要能量的現(xiàn)象。隨后研究發(fā)現(xiàn)相較于OXPHOS，即使在氧氣充足的情況下，腫瘤細(xì)胞普遍傾向于有氧糖酵解為其供能，并稱這一轉(zhuǎn)變?yōu)椤癢arburg效應(yīng)"。

有氧糖酵解是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的，在有氧情況下，1mol葡萄糖被糖酵解代謝為2mol丙酮酸，并獲得2mol ATP，而后丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下被還原成乳酸，獲得另外2mol ATP。雖然單分子葡萄糖的有氧糖酵解產(chǎn)能量低，但其反應(yīng)步驟少、產(chǎn)能速度高，總產(chǎn)能量大，更加可以滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的能量需求中。這一現(xiàn)象目前已認(rèn)為不僅是腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志特征之一，增殖細(xì)胞及其他體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞也能夠通過有氧糖酵解調(diào)整其能量和底物需求以應(yīng)對不斷變化的環(huán)境條件^[1]。

抑制糖酵解過程在治療前列腺癌研究中的應(yīng)用

2024年2月8日，武漢市中心醫(yī)院泌尿外科昌磊副主任醫(yī)師研究團(tuán)隊(duì)在Cell Communication and Signaling雜志上發(fā)表了題為“1-Pyrroline-5-carboxylate inhibit T cell glycolysis in prostate cancer microenvironment by SHP1/PKM2/LDHB axis"的研究論文。他們的研究表明，P5C通過靶向SHP1/PKM2/LDHB復(fù)合體來抑制T細(xì)胞的糖酵解過程。研究結(jié)果為制備抗P5C抗體提供了機(jī)制基礎(chǔ)，該抗體可用于恢復(fù)T細(xì)胞糖酵解和抑制前列腺癌的生長。

圖 SHP1、PKM2和LDHB相互結(jié)合，P5C抑制T細(xì)胞糖酵解^[2]。

注：糖酵解相關(guān)生化檢測指標(biāo)：丙酮酸激酶(PK, abs580073)、乳酸(LA, abs580160)、乳酸脫氫酶(LHD, abs580007)

接下來，小愛就以糖酵解系列試劑盒中的丙酮酸激酶檢測試劑盒為例，給大家詳細(xì)介紹使用方法。

丙酮酸激酶檢測試劑盒使用方法介紹

一、試劑盒組分

二、操作步驟：

1、材料和試劑準(zhǔn)備

自備材料：酶標(biāo)儀、蒸餾水、移液器與槍頭、研缽、離心機(jī)、計(jì)時器、濕冰等。

Substrate：使用前加入18mL Reaction Buffer溶解。

Enzyme：使用前加入1mL Assay Buffer 溶解。

Standard：使用前加入1mL蒸餾水溶解，然后取0.2mL加入到0.8mL蒸餾水中，獲得濃度為400μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

Positive Control：使用前加入0.5mL蒸餾水溶解。

2、樣本處理

1）細(xì)胞/細(xì)菌樣本：將細(xì)胞/細(xì)菌(5×10⁶)收集到離心管中，離心后去掉上清液，加入1mL Assay buffer，超聲處理（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）后于4℃，8000g離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，濕冰上保存待檢測；

2）組織樣本：稱取1g組織，加入1mL Assay buffer在濕冰上勻漿，4℃，8000g離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，濕冰上保存待檢測；

3）血清/血漿樣本：直接檢測。

3、上樣及檢測

上樣前將所有試劑加熱至37℃，然后按照如下表格加樣。

注：

1）對于標(biāo)準(zhǔn)品，可進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋（6個點(diǎn)左右），制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）對于未知的樣品，我們建議挑選幾個樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定樣品濃度和稀釋倍數(shù)。如果酶活力較低，請向反應(yīng)體系中加入更多的樣品，或增加反應(yīng)時間；如果酶活力較高，請稀釋樣品，或減少反應(yīng)時間。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線僅用于參考，每次實(shí)驗(yàn)都必須做一條新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測范圍：4μmol/L - 400μmol/L

降低濃度的陽性對照示例

常見問題解答

Q1：試劑盒中的96-Well Microplate只有一個，不夠?qū)嶒?yàn)使用怎么辦？

A1：該試劑盒中的96孔板是免費(fèi)送的，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以用常規(guī)的96孔酶標(biāo)板代替。

Q2：試劑盒操作說明書中既有標(biāo)準(zhǔn)曲線法又有公式法，我應(yīng)該選擇哪種計(jì)算方式？

A2：兩種方式任選一種就可以，公式是簡便算法，建議按照標(biāo)曲計(jì)算，會更加準(zhǔn)確。需要注意的是，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，每次實(shí)驗(yàn)必須重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Q3：試劑盒中的陽性對照需要和標(biāo)準(zhǔn)曲線一樣每次都做嗎？

A3：陽性對照不需要每次都做，可以在實(shí)驗(yàn)時做以幫助您確認(rèn)試劑盒是否有問題。當(dāng)然，也有老師每次做實(shí)驗(yàn)都會做陽性對照，以便在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不正常時排查實(shí)驗(yàn)?zāi)睦锍隽藛栴}。

[1] 楊柳易,王琛.有氧糖酵解對腎臟疾病影響的研究進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志, 2022,23(8):744-746.
[2] Chang L, Li G, Jiang S, et al. 1-Pyrroline-5-carboxylate inhibit T cell glycolysis in prostate cancer microenvironment by SHP1/PKM2/LDHB axis[J]. Cell Commun Signal. 2024;22(1):101. Published 2024 Feb 8. doi:10.1186/s12964-024-01493-1

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