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類器官污染鑒別與除菌攻略(一)

閱讀:401      發(fā)布時(shí)間:2024-10-29
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一、概述

 

類器官污染是一個(gè)老生常談的事情,尤其是做胃腸道,組織本身帶來(lái)的菌群數(shù)量非常龐大,一旦消毒不到位,就會(huì)導(dǎo)致類器官培養(yǎng)失敗。類器官污染常見(jiàn)類型有細(xì)菌、真菌、支原體、黑膠蟲(chóng)等污染源,今天小愛(ài)帶大家學(xué)習(xí)鑒別類器官污染及除菌方案。

 

二、類器官污染鑒別

 

1、細(xì)菌污染

 

細(xì)菌污染-肉眼下

 

污染特征:

● 肉眼下可明顯觀察基質(zhì)內(nèi)有明顯黑色球體物;

● 而且呈多個(gè)黑色球狀物分布;

● 生長(zhǎng)迅速,通常D1就有會(huì)出現(xiàn);

● 培養(yǎng)液隔夜即會(huì)變紅黃渾濁。

 

細(xì)菌污染-鏡下類器官原代提取D1

 

細(xì)菌污染特征:

● 細(xì)菌集落呈黑色團(tuán)球狀,wan全不透;

● 外圍模糊,有朦朧感;

● 爆發(fā)非???/strong>,一般1-2天即可出現(xiàn)大量集落。

 

細(xì)菌克星

貨號(hào)

抗生素

作用對(duì)象

使用比例

儲(chǔ)存條件

abs42020125

卡那霉素B硫酸鹽

細(xì)菌(G+,G-)支原體

母液濃度10mg/mL(無(wú)菌水溶解),工作濃度稀釋1:100

-20℃

abs42018967

硫酸慶大霉素溶液(10mg/mL)

細(xì)菌(G+,G-)支原體

稀釋1:200

-20℃

abs9244

青鏈雙抗

細(xì)菌(G+,G-)

稀釋1:100

-20℃

abs9246

青霉素-鏈霉素-兩性霉素B三抗

細(xì)菌(G+,G-)、真菌(如:酵母菌,霉菌)

稀釋1:100

-20℃

abs9245

青霉素-鏈霉素-慶大霉素三抗

細(xì)菌(G+,G-)、支原體

稀釋1:100

-20℃

 










2、真菌污染

 

左圖 真菌污染特征——霉菌

右圖 真菌污染特征——根霉

 

霉菌污染特征:

● 早期并不會(huì)使得培養(yǎng)基變黃變渾濁,但在顯微鏡下可觀察到菌絲體;

● 真菌形成的菌絲呈絲狀,管狀,樹(shù)枝狀,串珠狀。

 

真菌污染——酵母菌

 

小鼠胃類器官P0D1中發(fā)現(xiàn)的酵母菌團(tuán)從左到右依次是4X、10X、20X

 

類器官基質(zhì)膠中的酵母菌污染

 

類器官基質(zhì)膠中的酵母菌+根霉污染

 

酵母菌污染特征:

● 酵母菌呈類似棉花絮狀的團(tuán)狀物;

● 酵母菌等,當(dāng)其行出芽生殖時(shí)可從一大一小的連體結(jié)構(gòu)識(shí)別;

● 細(xì)胞被污染后,仍可生長(zhǎng),長(zhǎng)時(shí)間類器官活力狀態(tài)會(huì)變差;

● 梅雨季時(shí)的污染率會(huì)提高。

 

真菌克星

貨號(hào)

抗生素

作用對(duì)象

使用比例

儲(chǔ)存條件

abs42013298

兩性霉素B

真菌(如:酵母菌,霉菌)

母液濃度2.5mg/mL(DMSO溶解),工作濃度稀釋1:1000

-20℃

abs44071148

制霉菌素

真菌(如:酵母菌,霉菌)

母液濃度2mg/mL(DMSO溶解),工作濃度稀釋1:100

-20℃

abs9246

青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液(100×三抗)

細(xì)菌(如G+,G-)、真菌(如:酵母菌,霉菌)

稀釋1:100

-20℃

 








3、黑膠蟲(chóng)

 

 

黑膠蟲(chóng)污染特征:

● 活躍扭動(dòng);

● 多呈桿狀;

● 培養(yǎng)基不渾濁。

 

黑膠蟲(chóng)清除劑PLUS (500×) abs9841

 

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì):

1)性能穩(wěn)定:通過(guò)細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測(cè);通過(guò)滲透壓、pH檢測(cè);通過(guò)產(chǎn)品性能檢測(cè);

2)高效快速:有效實(shí)現(xiàn)對(duì)“黑膠蟲(chóng)"的抑制和滅殺,減少不必要的實(shí)驗(yàn)損失;

3)環(huán)保安全:經(jīng)上百種細(xì)胞驗(yàn)證無(wú)毒害作用。

 

使用方法:

1)請(qǐng)?jiān)谑盏截浐螅?將試劑管瞬時(shí)離心(3000rpm,3~5s)保存;

2)使用黑膠蟲(chóng)清除劑處理時(shí), 建議現(xiàn)配現(xiàn)用, 并保持細(xì)胞密度在50%~60%;

3)推薦稀釋比例為1:500。例如5mL培養(yǎng)基中加入10μL的黑膠蟲(chóng)清除劑。丟棄舊的培養(yǎng)基, 用PBS將細(xì)胞清洗干凈, 再加入含有黑膠蟲(chóng)清除劑的新鮮培養(yǎng)基, 2天一次,連續(xù)處理一周。

 

黑膠蟲(chóng)預(yù)防劑(1000×)abs9842

 

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì):

1)高效穩(wěn)定:通過(guò)產(chǎn)品性能檢測(cè),能夠有效防治細(xì)胞培養(yǎng)中的“黑膠蟲(chóng)"污染問(wèn)題;

2)環(huán)保安全:對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用,在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成影響,本產(chǎn)品為多肽類,不像抗生素會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并讓細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。

 

使用方法:

1)使用黑膠蟲(chóng)預(yù)防劑(1000X)時(shí), 建議現(xiàn)配現(xiàn)用;

2)推薦黑膠蟲(chóng)預(yù)防劑(1000X)的稀釋比例為1:1000, 例如:10mL的培養(yǎng)基加入10μL的黑膠蟲(chóng)預(yù)防劑(1000X)。

 

4、支原體污染

 

支原體是實(shí)驗(yàn)室中常見(jiàn)的污染細(xì)胞的原核生物,污染主要來(lái)自組織、血清等動(dòng)物性原材料和操作者本身。支原體直徑在0.1-0.3μm,顯微鏡下也很難分辨,一般通過(guò)吸取培養(yǎng)液上清采用qPCR技術(shù)擴(kuò)增DNA檢測(cè)。

 

1)檢測(cè)原理

 

TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針,其5’末端攜帶熒光基團(tuán)(報(bào)告基團(tuán)),如FAM、CY5、VIC等,3’端攜帶淬滅基團(tuán),如TAMRA、BHQ1等。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一條特異性的熒光探針,探針完整時(shí),熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(熒光定量PCR儀)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成wan全同步。本試劑盒采用多重PCR的方法,用2種不同的熒光探針?lè)謩e檢測(cè)目標(biāo)序列與內(nèi)參。

 

2)清除試劑

 

支原體清除試劑Plus abs9253

 

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì):

● 特異性清除培養(yǎng)基中的支原體;

● 只需要3-6天,便可以有效清除支原體;

● 活性成分為抗生素,不會(huì)產(chǎn)生耐藥性;

● 對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒性,在100多種細(xì)胞上進(jìn)行過(guò)驗(yàn)證,包括但不限于HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等;

● 廣譜性,可替代雙抗,可以清除常見(jiàn)的革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌;

● 可直接加入血清、培養(yǎng)基中,用于清除支原體污染。

 

3)使用方法

 

A、儲(chǔ)存液的配制: 

稱取適量支原體清除試劑,配制成10mg/mL的儲(chǔ)存液。適當(dāng)分裝后-20℃保存。如長(zhǎng)時(shí)間不使用,也可以-80℃保存;

 

B、預(yù)防支原體污染或抑制支原體:

在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入適量支原體清除試劑儲(chǔ)存液,使最終濃度為0.01-0.5μg/mL,通常推薦使用的濃度為0.2μg/mL或0.5μg/mL。在添加了前述劑量的支原體清除試劑的情況下,可以有效防止支原體污染或抑制支原體增殖;

 

C、清除污染的支原體:

對(duì)于發(fā)現(xiàn)或懷疑有支原體污染的細(xì)胞,在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入適量支原體清除試劑儲(chǔ)存液,使最終濃度為0.5-250μg/mL。推薦依次嘗試使用25、50、100和250μg/mL這4個(gè)濃度。在添加了前述劑量的支原體去除試劑的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周后,檢測(cè)是否還存在支原體污染。如果還是存在支原體污染,可以酌情提高支原體清除試劑的工作濃度。

 

5、非污染情況

 

因?yàn)轭惼鞴僭囵B(yǎng)中,會(huì)有很多雜質(zhì)、組織碎片、成纖維細(xì)胞等,容易造成細(xì)胞“污染"的假象,其實(shí)并非污染,如下所示:

 

1)成纖維細(xì)胞

成纖維細(xì)胞的胞體細(xì)長(zhǎng),又呈纖維樣,很容易被誤認(rèn)為是菌絲體,被誤判成真菌污染。其實(shí)仔細(xì)觀察,成纖維細(xì)胞成梭形,胞體中間粗,兩頭細(xì)長(zhǎng),而菌絲體整體粗細(xì)均勻。

 

左圖 基質(zhì)膠底層貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞

右圖 真菌污染特征——霉菌

 

2)組織碎片

在提取原代細(xì)胞的過(guò)程中,在組織解離過(guò)程中產(chǎn)生很多細(xì)胞碎片及雜質(zhì),故原代培養(yǎng)背景會(huì)比較臟,這種情況也容易被誤認(rèn)為污染。接下來(lái),小愛(ài)帶大家了解一下組織碎片特點(diǎn):

 

 

● 原代組織碎片往往成不規(guī)則形狀,區(qū)別于菌團(tuán)橢圓形菌落形態(tài);

 

 

● 原代組織雜質(zhì)往往大小不一,形態(tài)各異;菌團(tuán)形態(tài)均一,均為橢圓狀。

 

今天講解就到這了,大家如有實(shí)驗(yàn)問(wèn)題,歡迎一起交流哦!

  

本期小愛(ài)推薦


貨號(hào)

品名

規(guī)格

貨期

abs9841

黑膠蟲(chóng)清除劑PLUS(500×)

400uL×5

現(xiàn)貨

abs9842

黑膠蟲(chóng)預(yù)防劑(1000×)

500uL×5

現(xiàn)貨

abs9925

支原體檢測(cè)試劑盒(qPCR法)

50T

1-2周

abs9253

支原體清除試劑Plus

20mg/100mg

1-2周

abs42020125

卡那霉素B硫酸鹽

250mg

現(xiàn)貨

abs42018967

硫酸慶大霉素溶液(10mg/mL)

10mL

現(xiàn)貨

abs9244

青鏈雙抗

100mL

現(xiàn)貨

abs9246

青霉素-鏈霉素-兩性霉素B三抗

100mL

現(xiàn)貨

abs9245

青霉素-鏈霉素-慶大霉素三抗

100mL

現(xiàn)貨

abs42013298

兩性霉素B

1g/5g

現(xiàn)貨

abs44071148

制霉菌素

1g/5g

現(xiàn)貨




 

Absin產(chǎn)品線:

爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè));細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...

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