相信大家看著這個(gè)標(biāo)題,心情都是沉重的,尤其是對(duì)一些難養(yǎng)的類器官,好不容易養(yǎng)起來(lái)了,結(jié)果傳完代長(zhǎng)不起來(lái)了,這是啥情況啊?今天咱們從下面3個(gè)層面分析類器官傳代失敗原因。
影響類器官傳代因素
一、類器官傳代手法
影響類器官傳代最主要的因素是傳代手法。尤其是一些嬌貴的類器官,就像溫室的花朵,經(jīng)不起任何“風(fēng)雨",比如基質(zhì)膠冷化條件(溫度及時(shí)長(zhǎng))、離心條件(溫度、轉(zhuǎn)速、時(shí)長(zhǎng))、棄除上清時(shí)的類器官丟失、消化條件(溫度、時(shí)長(zhǎng))、吹打力度對(duì)于它們來(lái)說(shuō)就是“西天取經(jīng)路上的九九八十一難"。
(1)基質(zhì)膠冷化溫度、時(shí)長(zhǎng)
類器官傳代時(shí),我們需要把5-10孔(24孔板為例)的基質(zhì)膠和類器官混懸物用類器官傳代緩沖液(abs9730)吹散后收集到15mL離心管,并用類器官傳代緩沖液定容到14mL。接下來(lái)冷化基質(zhì)膠,可以選擇多種方式比如,4℃預(yù)冷30min; 0℃預(yù)冷30min;-20℃預(yù)冷5min。通常情況下,多數(shù)類器官都是可以采取上述三種方式,但少數(shù)類器官對(duì)溫度或時(shí)長(zhǎng)過(guò)于敏感。對(duì)溫度過(guò)于敏感的類器官建議采用4℃預(yù)冷30min或0℃預(yù)冷30min;對(duì)時(shí)長(zhǎng)過(guò)于敏感的類器官建議采用-20℃預(yù)冷5min。
(2)離心溫度、轉(zhuǎn)速、時(shí)長(zhǎng)
離心對(duì)類器官可能造成的損傷主要包括:
A、機(jī)械應(yīng)力損傷:離心過(guò)程中產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力可能會(huì)對(duì)類器官細(xì)胞造成破壞。這種損傷可能包括細(xì)胞膜的破裂、細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的損傷,以及細(xì)胞功能的喪失。
B、溫度影響:離心時(shí)的溫度對(duì)類器官的保存狀態(tài)有重要影響。如果離心溫度過(guò)高,可能會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)膠固化,影響類器官的分離和保存。因此,建議在4°C的低溫條件下進(jìn)行離心,以避免熱損傷。
基質(zhì)膠冷化后在進(jìn)行離心分層時(shí),建議選用水平角離心機(jī),轉(zhuǎn)速控制200g-300g,溫度設(shè)為4℃,時(shí)長(zhǎng)控制在5min以內(nèi)。
(3)棄除上清時(shí)的類器官丟失
分層現(xiàn)象(緩沖液、基質(zhì)膠、類器官沉淀)
離心后的類器官正常是分層三層:緩沖液、基質(zhì)膠、類器官沉淀,正常我們是保留類器官沉淀層,上面的緩沖液和基質(zhì)膠去掉。但如果我們?cè)囵B(yǎng)的類器官數(shù)量就很少,分層后的類器官沉淀層也會(huì)很少,這種情況下,我們不僅要保留類器官沉淀,還要保留基質(zhì)膠的下2/3,甚至基質(zhì)膠全層,以減少類器官的遺失(基質(zhì)膠層會(huì)殘留類器官)。點(diǎn)膠時(shí)保證新膠量是殘留膠的1.5倍體積以上,以保證基質(zhì)膠的貼壁粘附性。
當(dāng)然,有時(shí)候離心后的類器官離心后也會(huì)出現(xiàn)兩層:緩沖液、基質(zhì)膠類器官混懸液。這種情況,建議保留基質(zhì)膠類器官混懸液下2/3,甚至基質(zhì)膠全層,以減少類器官的遺失(基質(zhì)膠層會(huì)殘留類器官)。點(diǎn)膠時(shí)保證新膠量是殘留膠的1.5倍體積以上,以保證基質(zhì)膠的貼壁粘附性。
(4)消化溫度、時(shí)長(zhǎng)
上述離心后的類器官懸液在進(jìn)行消化傳代時(shí),那么要特別注意消化溫度、時(shí)長(zhǎng)的控制。消化過(guò)度對(duì)類器官造成的損傷體現(xiàn)在兩個(gè)方面:
A、細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞死亡:消化過(guò)強(qiáng)可能會(huì)破壞細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基中,引起細(xì)胞死亡。
B、細(xì)胞凋亡增加:胰酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)增加細(xì)胞的凋亡率。因?yàn)檫^(guò)度的消化可能對(duì)細(xì)胞膜造成損傷,影響細(xì)胞表面受體蛋白的功能性和完整性。
雖然消化酶在37℃下活性最好,但消化效力太強(qiáng)對(duì)類器官不一定是好事,通常我們?cè)谑覝爻瑑襞_(tái)內(nèi)進(jìn)行類器官消化就可以了,能更好地把控消化程度,及時(shí)根據(jù)鏡檢結(jié)果終止消化進(jìn)程。同時(shí),消化時(shí)長(zhǎng)建議2-3min即可(消化時(shí)間越長(zhǎng),可能會(huì)增加酶對(duì)類器官造成的損傷)。
(5)吹打力度
槍頭吹打在類器官培養(yǎng)中產(chǎn)生的主要有兩種力:機(jī)械損傷和剪切力。
A、機(jī)械損傷:這主要是指槍頭刮擦、細(xì)胞間相互碰撞等導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。為了減少這部分損傷,需要盡量減小吹打力度,只要保證能夠吹下吹散細(xì)胞就行。槍頭與細(xì)胞層接觸甚至研磨會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞直接死亡,因此在操作時(shí)需要控制槍頭與培養(yǎng)板底的間距,避免直接接觸。
B、剪切力:剪切力是指物體橫截面受到外力影響,沿外力方向相對(duì)移動(dòng)的現(xiàn)象,這個(gè)外力就叫做剪切力。 在細(xì)胞培養(yǎng)基里,如果有很多氣泡,細(xì)胞處在氣泡與培養(yǎng)基之間,當(dāng)氣泡破碎時(shí),細(xì)胞瞬間會(huì)受到強(qiáng)大的剪切力影響從而導(dǎo)致細(xì)胞碎裂。
如果選擇機(jī)械吹打傳代方式,吹打的力度和次數(shù)對(duì)類器官活性影響很大。如果用1mL槍頭吹打,操作一定要輕柔,避免液流剪切力多類器官造成割傷,也可使用無(wú)菌巴適吸管代替槍頭,對(duì)類器官傷害小。同時(shí)吹打次數(shù)控制在30次以內(nèi),可隨時(shí)鏡下觀察,一旦類器官?gòu)幕|(zhì)膠中解離出來(lái),并且有較多細(xì)胞團(tuán)塊,即可停止吹打。因此, 在進(jìn)行類器官吹打時(shí),需要特別注意控制力度和技巧,以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。
二、類器官本身
傳代后的肺癌類器官一周內(nèi)基本不長(zhǎng)
(1)類器官活性強(qiáng)度
不同種類的類器官活性差異很大,活性比較強(qiáng)的類器官有子宮內(nèi)膜癌類器官、腸癌類器官,培養(yǎng)相對(duì)容易很多,連續(xù)傳代甚至可達(dá)30多代。然而有些類器官本身活性不足,比如甲狀腺癌類器官,只能維持原代,傳代后基本不長(zhǎng)。除此以外,一致認(rèn)為難養(yǎng)的類器官還有肝癌類器官、前列腺癌類器官。
(2)類器官數(shù)量
如果在原代培養(yǎng)中類器官數(shù)量稀少,例如24孔板,每孔點(diǎn)50uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸物,長(zhǎng)成的類器官數(shù)量低于20個(gè),通常是類器官數(shù)量較少的情況。此時(shí),如果傳代操作不當(dāng),出現(xiàn)類器官大量丟失,就會(huì)導(dǎo)致傳下里的細(xì)胞團(tuán)密度過(guò)稀,缺少旁分泌信號(hào)調(diào)控,類器官增殖困難,出現(xiàn)長(zhǎng)不大現(xiàn)象。因此,原代類器官數(shù)量多少也直接影響是否能順利傳代。
三、營(yíng)養(yǎng)體系
(1)培養(yǎng)基
完quan培養(yǎng)基(添加因子)建議分裝儲(chǔ)存于-20℃,有效期長(zhǎng)達(dá)1年;保存在4℃,建議2周內(nèi)用完,超過(guò)1個(gè)月,因子活性會(huì)逐漸下降。
4℃儲(chǔ)存太久(一個(gè)月以上)會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的效能下降,而效能下降又是怎樣影響類器官傳代效果的呢?
舉個(gè)例子:消化傳代前后使用的是同一瓶培養(yǎng)基,原代養(yǎng)得可以,傳代不行了。大家在推斷原因時(shí)可能會(huì)首先排除培養(yǎng)基問(wèn)題,因?yàn)橄瘋鞔昂笫褂玫氖峭黄颗囵B(yǎng)基,如果是培養(yǎng)基的問(wèn)題,原代也養(yǎng)不好才對(duì),而結(jié)果是原代養(yǎng)得好,傳代不好了。這里其實(shí)有大家想不到的因素存在。大家都知道類器官通常傳到一定代次會(huì)出現(xiàn)類器官增殖變緩(比如數(shù)量減少和體積縮小),就傳不下去了。因?yàn)?/strong>類器官培養(yǎng)的成體干細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞,在經(jīng)歷多次傳代后,干性(自我更新和分化能力)都會(huì)逐代降低,最后就傳不下去。在類器官原代培養(yǎng)中,腫瘤干或成體干細(xì)胞干性很強(qiáng),即便使用4℃儲(chǔ)存過(guò)久的培養(yǎng)基,依然可以增殖起來(lái)。而當(dāng)不斷傳代后,腫瘤干或成體干細(xì)胞干性逐漸下降,對(duì)培養(yǎng)基的因子活性需求就會(huì)提高,再使用4℃儲(chǔ)存過(guò)久的培養(yǎng)基就會(huì)難把類器官擴(kuò)增起來(lái)。
(2)類器官傳代消化液
消化液對(duì)類器官傳代的影響主要體現(xiàn)在2個(gè)方面:
A、傳代消化液是否恰當(dāng),不合適的酶會(huì)造成類器官損傷。
B、傳代消化液建議分裝保存在-20℃,有效期長(zhǎng)達(dá)1年,保存在4℃下,建議2周內(nèi)用完,超過(guò)1個(gè)月,酶活會(huì)逐漸下降。
首先,消化酶的消化力度還取決于酶的種類。我們嘗試過(guò)胰酶進(jìn)行類器官消化,發(fā)現(xiàn)胰酶對(duì)類器官的消化損傷比較大,不適合作為類器官傳代消化酶。所以,建議大家使用專用的類器官傳代消化液(abs9520),其采用的多種溫和消化酶對(duì)類器官消化比較溫和。其次,消化液如果長(zhǎng)時(shí)間存放于4℃,酶活會(huì)逐漸降低,消化類器官需要時(shí)間會(huì)想要增加,而增加消化時(shí)間,把控時(shí)長(zhǎng)不當(dāng),容易導(dǎo)致消化過(guò)度,使類器官活性受損。
(3)基質(zhì)膠
基質(zhì)膠建議分裝保存在-20℃,有效期長(zhǎng)達(dá)1年,保存在4℃下,建議2周內(nèi)用完,超過(guò)1個(gè)月,基質(zhì)膠的粘附性和因子活性會(huì)逐漸下降。
基質(zhì)膠的作用有兩個(gè),其一是起支架作用,維持類器官的橢球形態(tài),其二是含有豐富的因子種類,對(duì)類器官的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。當(dāng)基質(zhì)膠存4℃儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)久,基質(zhì)膠的粘附性和因子活性均會(huì)大大降低,此時(shí)的基質(zhì)膠類器官穹頂結(jié)構(gòu)容易脫離培養(yǎng)板底面而漂浮,同時(shí)也難以維持類器官增殖需求。
今天講解就到這了,大家如有實(shí)驗(yàn)問(wèn)題,歡迎一起交流哦!
類器官培養(yǎng)產(chǎn)品推薦
貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 |
abs9920 | 類器官回收液 | 100mL |
abs9730 | 類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 | 250mL/500mL |
abs9520 | 類器官傳代消化液 | 100mL/500mL |
abs9495 | 基質(zhì)膠(低因子,無(wú)酚紅) | 1.5mL×4/1.5mL×8 |
abs9445 | Organotial人腸癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs9786 | Organotial人肝膽管癌類器官培養(yǎng)試劑盒 | 1kit |
abs50059 | 2D/3D/Organoid ATP Viability Assay Kit | 10mL/100mL |
Absin產(chǎn)品線:
爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè));細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...
特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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