一、實驗準備

TILs提取培養(yǎng)試劑盒（abs90045）

需要額外準備的試劑及耗材

試劑到貨處理：

1）TIL細胞擴增培養(yǎng)基A 、TIL細胞激活培養(yǎng)基B在4℃可保存3個月，收到貨后4℃保存，建議1個月內(nèi)使用完畢，長期不用建議放于-20℃儲存，避免反復凍融超過2次；

2）組織保存液G、組織消化液C內(nèi)含有維持細胞活性營養(yǎng)成分，為了保持試劑營養(yǎng)成分的活性，長期不用建議放于-20℃儲存，避免反復凍融超過2次。

二、操作步驟與方法：

1 組織前處理

1.1 實驗材料

需提前準備緩沖液F（4℃預(yù)冷）、組織保存液G、取樣管、組織運輸箱、冰袋

1.2 組織的獲取與運輸

● 組織的取樣與運輸是TIL提取成功的第一個環(huán)節(jié)也是最容易忽視的環(huán)節(jié)，若組織前期保存不當會導致細胞活性差、污染、正常細胞少等問題，降低TIL提取成功率；

● 組織應(yīng)在離體的30min內(nèi)放入組織保存液G，緩沖液F清洗3-5次，將組織表面血液沖洗干凈，放入組織保存液G中，取樣管于4℃低溫保存運輸（72h內(nèi)）。

2 TIL細胞提取

2.1 實驗材料

需提前準備緩沖液F(4℃)、組織消化液C(37℃)、分離液D、分離液E、TIL擴增培養(yǎng)基A、TIL激活培養(yǎng)基B（室溫或37℃）、鑷子(10cm)、尖頭眼科手術(shù)剪/手術(shù)刀片、一次性60mm培養(yǎng)皿、1.5 mL/15mL/50mL離心管、100μm細胞濾網(wǎng)、3mL無菌巴氏吸管/移液槍、24孔細胞培養(yǎng)板、金屬冰盒。

2.2 組織的處理

取材后的組織建議在2-8℃條件下保存運輸，快速轉(zhuǎn)運至潔凈實驗室進行TIL提取實驗流程，組織拍照并登記詳細信息。

2.2.1 組織的清洗

取樣管消毒后，在超凈臺中將組織取出來，放入培養(yǎng)皿中，加入緩沖液F，用3mL巴氏吸管或1000μL移液槍吹打清洗，重復清洗操作三次及以上。

2.2.2 組織的解離與消化

用眼科剪或手術(shù)刀片去除組織雜質(zhì)，鑷子轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中，用眼科剪進一步將組織機械解離成體積約為1-3mm³的組織塊，轉(zhuǎn)移至15mL EP管中，加入8mL組織消化液37℃震蕩消化60min。消化過程每20min顯微鏡下觀察組織消化情況，取少量消化液在顯微鏡下觀察，觀察到較多的單個細胞后進行下一步操作。

2.2.3 組織的過濾

加入3倍體積的緩沖液F終止消化，消化完成組織通過100μm孔徑的細胞篩網(wǎng)過濾，收集濾液。

2.3 TIL細胞分離

按順序依次添加TIL分離液D 2mL，分離液E 4mL于15mL離心管，再沿離心管壁輕輕加入組織濾液6mL，2000轉(zhuǎn)離心20min，收集D分離液界面上的細胞，該層富含TIL細胞的懸液，離心1500轉(zhuǎn)10min。分離液E的界面層主要為腫瘤細胞。再用緩沖液F清洗TIL細胞洗2次，以除去細胞分離液，得到TIL細胞沉淀。如果此時不進行細胞激活及擴增，可選擇合適的TIL細胞量進行程序降溫凍存。

3 TIL細胞激活擴增培養(yǎng)（以24孔板為例）

3.1 實驗材料

需提前準備緩沖液F(4℃)、TIL擴增培養(yǎng)基A，TIL激活培養(yǎng)基B（室溫或37℃）、15mL/離心管、3mL無菌巴氏吸管/移液槍、24孔細胞培養(yǎng)板。

3.2 TIL細胞激活

● 將分離好的TIL細胞計數(shù)；

● TIL細胞激活培養(yǎng)基B重懸TIL細胞（濃度200000cell/mL），每孔添加1.5mL TIL細胞激活培養(yǎng)基B，連續(xù)激活48h。

3.3 TIL細胞擴增

● 激活后的TIL細胞，緩慢沿細胞板側(cè)壁吸取TIL細胞激活培養(yǎng)基B（注意：不要吸取細胞）；

● 每孔添加1.5mL TIL細胞擴增培養(yǎng)基A連續(xù)擴增培養(yǎng)；

● 在連續(xù)培養(yǎng)第4天（此時可觀察到T細胞明顯成團），緩慢沿細胞板側(cè)壁吸取TIL細胞擴增培養(yǎng)基A，添加新鮮TIL細胞擴增培養(yǎng)基A，連續(xù)培養(yǎng)5天（此時可觀察到大量T細胞明顯成團懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)）；

● 培養(yǎng)后的細胞也可進行流式分選鑒定。

4 TIL細胞傳代（以24孔板為例）

將懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)的T細胞團收集于15mL離心管，1000轉(zhuǎn)離心5min，細胞計數(shù)（濃度為200000cell/mL）。TIL細胞擴增培養(yǎng)基A重新接種24孔細胞培養(yǎng)板。根據(jù)接種密度不同48-72h可完成擴增。

5 TIL細胞凍存

5.1 實驗材料

傳代緩沖液F(4℃)、TIL凍存液H(4℃)、15mL離心管、細胞凍存管、程序降溫盒、移液槍

5.2 凍存步驟

將懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)的T細胞團收集于15mL離心管，1000轉(zhuǎn)離心5min，細胞計數(shù)，添加TIL凍存液H（濃度為5000000cell/mL），轉(zhuǎn)移至細胞凍存管內(nèi)，進行程序降溫。

6 TIL細胞復蘇（以24孔板為例）

TIL細胞的復蘇分兩種情況，一種是TIL細胞提取以后，立即凍存，后續(xù)復蘇需要激活；一種是TIL細胞激活擴增后凍存，后續(xù)復蘇不需要激活。

6.1 TIL細胞提取之后立即凍存，復蘇需要激活，步驟如下：

6.1.1 實驗材料

緩沖液F、TIL細胞擴增培養(yǎng)基A、 TI細胞L激活培養(yǎng)基B、24孔細胞培養(yǎng)板、15mL離心管、水浴鍋、3mL無菌巴氏吸管/移液槍。

6.1.2 復蘇步驟

● 取15mL離心管，添加8mL緩沖液F待用；

● 從低溫環(huán)境中取出凍存的細胞，快速置于37℃水浴鍋中融解，水浴融解過程中，需輕輕搖動凍存管，以確保凍存液在短時間內(nèi)wan全融解。將解凍后的T細胞快速轉(zhuǎn)移至15mL離心管，使用移液槍輕柔吹打6-8次，1000轉(zhuǎn)離心5min棄上清。將T細胞沉淀計數(shù)，添加合適的TIL細胞激活培養(yǎng)基B混勻（濃度500000cell/mL），每孔添加1.5mL混合液于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)觀察培養(yǎng)48h；

● 激活后的TIL細胞，緩慢沿細胞板側(cè)壁吸取TIL細胞激活培養(yǎng)基B（注意：不要吸取細胞）；

● 每孔添加1.5mL TIL細胞擴增培養(yǎng)基A連續(xù)擴增培養(yǎng)；

● 在連續(xù)培養(yǎng)第4天（此時可觀察到T細胞明顯成團），緩慢沿細胞板側(cè)壁吸取TIL細胞擴增培養(yǎng)基A，添加新鮮TIL細胞擴增培養(yǎng)基A，連續(xù)培養(yǎng)5天（此時可觀察到大量T細胞明顯成團懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)）；

● 培養(yǎng)后的細胞也可進行流式分選鑒定。

6.2 TIL細胞激活擴增后凍存，后續(xù)復蘇不需要激活，步驟如下：

6.2.1 實驗材料

緩沖液F、 TIL細胞擴增培養(yǎng)基A、24孔細胞培養(yǎng)板、15mL離心管、水浴鍋、3mL無菌巴氏吸管/移液槍

6.2.2 TIL細胞復蘇培養(yǎng)

● 取15mL離心管，添加8mL緩沖液F待用；

● 從低溫環(huán)境中取出凍存的細胞，快速置于37℃水浴鍋中融解，水浴融解過程中，需輕輕搖動凍存管，以確保凍存液在短時間內(nèi)wan全融解。將解凍后的T細胞快速轉(zhuǎn)移至15mL離心管，使用移液槍輕柔吹打6-8次，1000轉(zhuǎn)離心5min棄上清。將T細胞沉淀計數(shù)，添加合適的TIL細胞擴增培養(yǎng)基A（濃度500000cell/mL）混勻，每孔添加1.5mL混合液于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)觀察培養(yǎng)。

今天講解就到這了，大家如有細胞培養(yǎng)問題，歡迎一起交流哦！

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