簡介

哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械力的能力 推動、拉動或擠壓 是細(xì)胞單獨和共同用作組織以執(zhí)行重要生理功能的固有能力。為了更好地理解細(xì)胞力產(chǎn)生背后的機(jī)制，確定新的藥物靶點或候選藥物，并驗證被認(rèn)為影響力產(chǎn)生的現(xiàn)有候選藥物，必須采用定量篩選方法對細(xì)胞力進(jìn)行功能評估。

優(yōu)勢

使用帶熒光標(biāo)記微圖案的 384 孔板篩選大型藥物文庫，以了解其對細(xì)胞收縮力的影響

在較長的實驗時間內(nèi)追蹤每個細(xì)胞群中每個細(xì)胞的收縮力

使用高通量、全孔成像加速采集

由于功能性細(xì)胞輸出驅(qū)動了這些疾病，因此測量收縮力生成本身，而不是鈣流等非特異性分子替代物，對于最大限度地提高藥物開發(fā)的成功至關(guān)重要。本研究報告了我們開發(fā)的稱為 FLECS（熒光彈性收縮表面）的自動化單細(xì)胞功能收縮性測定法，用于評估細(xì)胞的張力收縮性和測試化合物調(diào)節(jié)細(xì)胞施加力的能力。從 6 名致命性
哮喘患者和 6 名非哮喘患者獲得的原代人氣道平滑肌 （HASM） 細(xì)胞在收縮張力、對激動劑緩激肽的反應(yīng)以及最終支氣管擴(kuò)張劑福莫特羅方面進(jìn)行了比較。
使用單塊 FLECS 384 孔板評估所有 12 個細(xì)胞系的單細(xì)胞收縮力，并使用 ImageXpress Micro 4 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，該系統(tǒng)能夠在一張4倍放大的圖像中捕獲了384孔板的整個區(qū)域(圖1)。ImageXpress Micro 4系統(tǒng)提供的一致的寬視場成像可以在很長的實驗周期內(nèi)以4分鐘的間隔跟蹤超過100,000個收縮的單細(xì)胞。

圖 1：含有細(xì)胞結(jié)合熒光微圖案的 FLECS 384 孔板的單孔。

（A） 使用 ImageXpress Micro 4 系統(tǒng)，可以 4X放大采集 384 孔板的整個單孔。（B） 嵌入彈性基底的熒光微圖案（綠色）被單細(xì)胞（以紅色染色的肌動蛋白，以藍(lán)色染色的細(xì)胞核）粘附和擠壓，導(dǎo)致相對于空孔微圖案的規(guī)則和可量化的尺寸變化，與細(xì)胞產(chǎn)生的力的大小相對應(yīng)。

Materials

•       FLECS 檢測試劑盒

•       384 孔 FLECS 板（Forcyte Biotechnologies）

•       Hoechst 33342 細(xì)胞核染色劑 （ThermoFisher）

•       原代人氣道平滑肌細(xì)胞（6 個健康供體和 6 個哮喘供體）- 由羅格斯大學(xué)羅格斯轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究所 Panettieri 實驗室提供

•       化學(xué)品

•       醋酸緩激肽 （Millipore Sigma）

•       福莫特羅 （Millipore Sigma）

•       采用 MetaXpress 軟件的 ImageXpress Micro 4 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（Molecular Devices）

評估12種患者源性HASM細(xì)胞的功能收縮性 

FLECS 384 孔板的功能收縮性，這些板包含一系列熒光標(biāo)記的細(xì)胞外基質(zhì) （ECM） 微圖案，這些微圖案具有共價嵌入軟基膜中的特定形狀和大小，并接種有待評估的細(xì)胞。該研究評估了源自12名患者的 12 株原代 HASM 細(xì)胞，其中 6 株為致命性哮喘，6 株為非哮喘，每對為年齡、性別和種族匹配。

將原代 HASM 細(xì)胞接種在 384 孔板中，并帶有熒光標(biāo)記的微圖案。將細(xì)胞在 37°C 的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 小時。使細(xì)胞粘附在這些模型上，以便應(yīng)用各種處理。然后，在 37°C 下用 Hoechst 33342 對細(xì)胞染色 15 分鐘，以鑒定與微圖案結(jié)合的單細(xì)胞。細(xì)胞收縮在下面的彈性膜上產(chǎn)生機(jī)械力，并在圖案周圍產(chǎn)生校準(zhǔn)良好的位移。在 ImageXpress Micro 4 系統(tǒng)上使用 4X 物鏡采集細(xì)胞結(jié)合微圖案的基線圖像（細(xì)胞核的 DAPI 和熒光標(biāo)記的微圖案的FITC）。然后，用激動劑（10 pM 緩激肽）處理細(xì)胞，每 4 分鐘對微圖案進(jìn)行一次成像，持續(xù) 12 分鐘（僅 FITC 通道）。然后，用支氣管擴(kuò)張劑（50 pM 福莫特羅）或溶媒對照處理細(xì)胞，并微圖案每 4 分鐘成像一次，持續(xù) 16 分鐘（僅 FITC 通道）。然后，在 37°C 下孵育平板 10 分鐘，然后獲取最終圖像。按照圖 2 所示的程序測量了基底張力、對緩激肽的收縮反應(yīng)、對支氣管擴(kuò)張劑福莫特羅的敏感性以及這些反應(yīng)的動力學(xué)。

圖 2. 將 12 個細(xì)胞系接種到 FLECS 384 孔板中的實驗步驟示意圖。

圖 3. 用于處理收縮力數(shù)據(jù)的 Forcyte 算法。 算法 （i） 識別和測量圖像集 1 中的所有微圖案，（ii） 交叉引用圖像集 2 中每個微圖案的位置，以及 （iii） 確定是否存在 0、1 或 >2 個細(xì)胞核（即細(xì)胞）。將包含單個細(xì)胞核（即 1 個細(xì)胞）的微圖案的平均中心至末端位移與包含 0 個細(xì)胞核（即未占用模式）的所有未位移模式的相應(yīng)測量值的中位數(shù)進(jìn)行比較，并將差異繪制為水平直方圖。

識別與微圖案結(jié)合的單細(xì)胞并計算位移

圖像從 MetaXpress 軟件導(dǎo)出，并使用 Forcyte 算法處理用于收縮力數(shù)據(jù)（圖 3）。根據(jù) Hoechst 染色法鑒定與微圖案結(jié)合的單細(xì)胞。排除了多個細(xì)胞結(jié)合的模式。對于由單個單元綁定的每個模式，中心與每個終端之間的平均距離包括一個數(shù)據(jù)點。

疾病細(xì)胞與正常細(xì)胞的收縮力特征隨時間推移而明顯不同，對 ~31，000 個激動劑反應(yīng)細(xì)胞（來自 12 個細(xì)胞系）中的每一種進(jìn)行追蹤，從而選擇 16 分鐘時收縮增加的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析（平均約 72% 的細(xì)胞）。我們追蹤了所有選定細(xì)胞的收縮分布變化（圖 4A），發(fā)現(xiàn) BK 處理后分布顯示出穩(wěn)健的向上變化，這些變化在添加賦形劑后未減弱，但在福莫特羅處理后停止或逆轉(zhuǎn)。

在藥物治療過程中追蹤了每個細(xì)胞群的中位收縮力值（圖 4B），并觀察到，對于 6 對年齡、種族和性別匹配的伴或不伴致死性哮喘的患者中的 5 對，哮喘患者的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的色調(diào)、更大的 BK 誘導(dǎo)收縮，或兩者兼而有之。在這些病例中，有 4 例的差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性（圖 5）。

圖 4. 從微圖案圖像中收集的收縮力數(shù)據(jù)。（A） 單細(xì)胞收縮率測定的群體水平直方圖，在使用前收縮激動劑緩激肽以及后來的支氣管擴(kuò)張劑福莫特羅或溶媒對照（1 名患者）治療后隨時間變化。（B） 所有 12 名患者的群體范圍內(nèi)直方圖得出的中位值。

圖 5. 年齡、性別和種族匹配的供體細(xì)胞的成對比較。

結(jié)論

結(jié)論

FLECS 孔板產(chǎn)品和 ImageXpress Micro 4 系統(tǒng)提供了一種功能上篩選大型藥物庫的方法，以檢測已知與疾病過程有關(guān)的對細(xì)胞收縮力的影響。使用 FLECS 孔板檢測單細(xì)胞收縮力，其中大量精確形狀的粘合劑和熒光微圖案沉積在標(biāo)準(zhǔn)微孔板底部的彈性膜上，可快速評估原代細(xì)胞或細(xì)胞系的功能性力生成，這些細(xì)胞或細(xì)胞系粘附在這些微圖案上，并通過力生成引起尺寸變化。ImageXpress Micro 4 系統(tǒng)可快速（<10 分鐘/整塊 384 孔板）采集整個孔（一個圖像中的完整 384 孔面積），空間分辨率足以觀察細(xì)胞收縮力的微小差異。快速、全孔成像使 FLECS 技術(shù)可用于高通量篩選應(yīng)用以及研究細(xì)胞力生成的高分辨和多維實驗。本研究是之前發(fā)表的一項更大研究的一部分1。

參考

1. Pushkarsky， I. 等人 用于高通量單細(xì)胞力細(xì)胞測定的彈性傳感器表面。Nature Biomedical Engineering 2， 124-137 （2018）。