9
流式細胞儀檢測樣品的制備方法
流式細胞儀檢測樣品推薦制備方法：
A. 直接標記抗體(FITC標記抗體)：
(1) 、收集1×106個細胞，800rpm離心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
(2) 、用4%多聚甲醛1ml室溫固定40分鐘，800rpm離心5min去上清。加2ml PBS重懸洗滌細胞，800rpm離心5min。
(3) 、用1ml含5% 人血清的 PBS 重懸細胞，冰上孵育10min，800rpm離心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和飽和劑量的熒光標記抗體(5×105個細胞/20ul抗體)的PBS ,避光冰上放置30min,離心棄上清。加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待測即可。
(4) 、用流式細胞儀檢測熒光值,每管計數(shù)10 000個細胞。
B. 未標記抗體間接免疫熒光標記法：
(1)、收集2×106個細胞，用冷的PBS 2ml 洗滌細胞一次，800rpm離心5min。
(2)、用2ml 4%多聚甲醛室溫固定細胞40min,800rpm離心5min；2ml PBS重懸細胞，800rpm離心5min；
(3)、用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重懸細胞，冰上放置10min,800rpm離心5min。
(4)、加入飽和劑量未標記抗體，冰上放置40min,800rpm離心5min，用2ml冷的PBS 重懸細胞，800rpm離心5min，洗去未結合一抗，重復一次。
(5)、加入熒光標記(FITC)標記的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm離心5min，去上清，PBS洗滌兩次。
(6)、加入0.5ml 1%多聚甲醛重懸細胞；固定待測。
(7)、流式細胞儀檢測熒光值,每管計數(shù)10 000個細胞。
C.細胞周期、細胞凋亡及DNA倍體分析樣品(PI染色)的制備：
(1)、待測樣本制成單細胞懸液，然后2000轉/分離心5分鐘，棄上清。
(2)、用4℃預冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小時。
(3)、調(diào)整細胞濃度為106細胞/毫升，取1毫升細胞懸液，用PBS洗三次，細胞重懸于1毫升PI染液中，37℃孵育30分鐘即可進行流式分析。
(4)、PI染液終濃度為50微克/毫升，RNase A終濃度為20微克/毫升。