（Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓｎｕｎｔｉａ） 和 雙 齒 圍 沙 蠶 （Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ
ａｉｂｕｈｉｔｅｎｓｉｓ）等，北 方 （遼 寧、山 東 和 河 北） 以
日本刺沙蠶居多，南方 （江蘇、福建和浙江）以雙
齒圍沙蠶為主。ＮＶ 蛋白酶 （曾用名：溶栓素）是
一種本課題組首先分離純化的 絲 氨 酸 蛋 白 水 解
酶［１］，該酶已在Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ蛋白庫中著錄 （著錄號
為 Ｐ８３４３３）， 申 請 了 我 國 專 利 （申 請 號 為
０２１４４８２８．０） 并 獲 得 專 利 公 開 （公 開 號 為
１５００８７３）。本文作者在完成 ＮＶ 蛋白酶純化工藝和
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上［２－４］，進(jìn)一步獲得 ＮＶ 蛋白 酶 藥
理學(xué)研究數(shù)據(jù)［５－６］。本研究旨在為 ＮＶ 蛋白 酶 的 凍
干工藝確定相關(guān)技術(shù)參數(shù)。
１ 材料與方法
１．１ 主 要 試 劑 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５ 購 自 美 國
Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司，ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ
購自 美 國 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司，偶 氮 酪
蛋白、ｄ－１０樟腦磺酸、六次甲基四胺和 Ｔｗｅｅｎ８０
均購自美國Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司，其他藥品購自北
京化學(xué)試劑公司。
１．２ ＮＶ 蛋白酶的活性測 定 在０．０１ ｍｏｌ·Ｌ－１
Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４ （ｐＨ ７．３） 緩 沖 條 件 下 制 備
ＮＶ 蛋白酶溶液，分別檢測４℃～４５℃時(shí) ＮＶ 蛋白
酶的活性。分別使用０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１的不同ｐＨ 緩
沖液 （表 １），預(yù)洗 脫 ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５ 色譜 柱，凍
干 制 備 的 ＮＶ 蛋 白 酶 上 樣 洗 脫， 分 別 制 備 在
０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１上述緩沖體系下的 ＮＶ 蛋白 酶 溶 液
并檢測其活性。
表１ ＮＶ 蛋白酶的緩沖體系
Ｔａｂ．１ ＢｕｆｆｅｒｓｙｓｔｅｍｆｏｒＮＶｐｒｏｔｅａｓｅ
ｐＨ Ｂｕｆｆｅｒ 　　
１．０ ＫＣｌ－ＨＣｌ
２．０ Ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ－Ｎａ２ＨＰＯ４
３．０ Ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ－Ｎａ２ＨＰＯ４
４．０ Ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ－Ｎａ２ＨＰＯ４
５．０ Ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ－Ｎａ２ＨＰＯ４
６．０ Ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ－Ｎａ２ＨＰＯ４
７．０ Ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ－Ｎａ２ＨＰＯ４
８．０ Ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ－Ｎａ２ＨＰＯ４
９．０ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ
１０．０ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ
ＮＶ 蛋白酶活性檢測采用偶氮酪蛋白方法：經(jīng)
卡馬斯亮 藍(lán) Ｇ－２５０染料 結(jié) 合 法 定 量 后，配 成 濃 度
為０．２ｇ·Ｌ－１的 ＮＶ 蛋白酶溶液。５０μＬＮＶ 蛋白
酶溶液與５００μＬ０．５％ 偶氮 酪 蛋 白 溶 液 混 合，在
３７℃ 條件下保溫１０ｍｉｎ。加入１０％ 三氯乙酸溶液
１ｍＬ，以 Ｐａｒａｆｉｌｍ 薄膜 封 住 管 口，于 振 蕩 器 上 振
蕩。１００００ｒ·ｍｉｎ－１離心２ｍｉｎ，將上清液移入比
色皿，以上述相應(yīng)ｐＨ 值的緩沖液為空白對照，在
４４０ｎｍ 處測定 吸 光 度 （Ａ）值?；?性 檢 測 分 別 重
復(fù)３次。
１．３ ＮＶ 蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)檢測 采用６２ＡＤＳ型
圓二色 譜 儀 （美 國 ＡＶＩＶ 公司）表 征 ＮＶ 蛋白 酶
的二級結(jié)構(gòu)。采用１ｇ·Ｌ－１ｄ－１０樟腦磺酸水溶液，
以１ｍｍ 的吸收池校正儀器。試劑用水為經(jīng)石英雙
蒸餾水器蒸餾的新雙蒸餾水，所有試劑皆為現(xiàn)用現(xiàn)
配，并用高純度氮?dú)怙柡汀＃危?蛋白酶遠(yuǎn)紫外圓二
色譜測定選用光程為 １ ｍｍ 的 吸 收 池，在 ２００～
２５０ｎｍ 間掃 描。測 試 前 充 分 恒 溫 （２ｈ），每個(gè) 測
試結(jié)果均為３次單獨(dú)測定的平均結(jié)果。蛋白質(zhì)二級
結(jié)構(gòu)的計(jì)算采用奇異值分解zui小二乘法計(jì)算，結(jié)構(gòu)
數(shù)據(jù)微分分析采用 Ｏｒｉｇｉｎ６．０軟件，雙變量相關(guān)性
分析采用ＳＰＳＳ１０．０數(shù)據(jù)分析軟件。
１．４ ＮＶ 蛋 白 酶 的 凍 干 過 程 ０．０１ ｍｏｌ·Ｌ－１
Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４ （ｐＨ７．３）緩沖條件下制備的
ＮＶ 蛋白酶溶液裝入５ｍＬ 西林瓶，將西林瓶置于
凍 干 托 盤， 放 置 到 預(yù) 先 滅 菌 處 理 的 ＶｉｒＴｉｓ
Ａｄｖａｎｔａｇｅ凍干機(jī)中。啟動(dòng)真空泵，將冷凍倉真空
度降為２００Ｔｏｒｒ。啟動(dòng)擱板制冷，－４０℃預(yù)凍４ｈ。
將 擱 板 溫 度 升 至 －１０℃， 第 一 階 段 干 燥 時(shí) 間
１３．５ｈ。將擱板溫度升至０℃，第二階段干燥時(shí)間
８ｈ，至冷凍倉真空度 為２５０Ｔｏｒｒ，終止 凍 干。啟
動(dòng)壓蓋程序，將西林瓶封嚴(yán)。
１．５ ＮＶ 蛋白酶凍干品復(fù)溶后濁度測定 吸取 硫
酸肼 溶 液 ５ ｍＬ 與 六 次 甲 基 四 胺 溶 液 ５ ｍＬ 于
１００ｍＬ容 量 瓶 中 混 勻。２５℃ ±３℃ 下 靜 置 反 應(yīng)
２４ｈ。冷后用 水 稀 釋 至 標(biāo) 線，混 勻。此 溶 液 濁 度
（單位：ＮＴＵ）為４００ＮＴＵ。吸取 濁 度 標(biāo) 準(zhǔn) 液０、
０．５０、１．２５、２．５０、５．００、１０．００ 和 １２．５０ ｍＬ，
置于比色管中，加水至標(biāo)線。搖勻后，即得濁度為
０．４、１０．０、２０．０、４０．０ 及 ８０．０ ＮＴＵ 的 標(biāo) 準(zhǔn) 系
列。于６８０ｎｍ 波長 測 定 濁 度 標(biāo) 準(zhǔn) 液 吸 光 度 （Ａ）
值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。吸取 ＮＶ 蛋白酶凍干
品生理鹽水 復(fù) 溶 液 于 比 色 管 中 測 定 Ａ 值，由 標(biāo) 準(zhǔn)
曲線回歸方程計(jì)算樣品濁度。
１．６ 不同濃 度 Ｔｗｅｅｎ８０條件 下 ＮＶ 蛋白 酶 凍 干
品的復(fù)溶 對 ＮＶ 蛋白酶樣品分別添加０．０１５％、
０．０１０％ 和 ０．０１５％ 的 Ｔｗｅｅｎ ８０， 采 用 ２．０、
８１２ 吉林大學(xué)學(xué)報(bào) （醫(yī)學(xué)版） 第４３卷 第１期 ２０１７年１月
２．５和３．０ ℃·ｍｉｎ－１冷凍 速 率 凍 干，其 余 凍 干 技
術(shù)參數(shù)見１．４。
２ 結(jié) 果
２．１ 不同溫度下 ＮＶ 蛋白酶二級結(jié)構(gòu)和活性 在
４℃～４５℃ 范圍內(nèi)，ＮＶ 蛋白酶α－螺旋結(jié)構(gòu)比率和
活性隨溫度升高呈下降趨勢，β－折疊結(jié)構(gòu)比率變化
不明 顯。ＮＶ 蛋 白酶活性與溫度呈正相關(guān)關(guān)系
（ｒ＝０．７５３，Ｐ＜０．０１）。α－螺旋 結(jié) 構(gòu) 比 率 與 溫 度 和
活性均 呈 負(fù) 相 關(guān) 關(guān) 系 （ｒ＝ －０．９６８，Ｐ＜０．０１）。
ＮＶ 蛋白酶β－折疊結(jié)構(gòu)比率與溫度和活性均無相關(guān)
關(guān)系 （Ｐ＞０．０５） （圖１）。經(jīng)奇異值分解zui小二乘
法計(jì)算 和 結(jié) 構(gòu) 數(shù) 據(jù) 微 分 分 析，α－螺旋 結(jié) 構(gòu) 是 維 持
ＮＶ 蛋白 酶 在 不 同 溫 度 條 件 下 的 主 要 結(jié) 構(gòu) 構(gòu) 象，
２種結(jié)構(gòu)變化的相變點(diǎn)為３６．８℃。
圖１ 不同溫度下 ＮＶ 蛋白酶二級結(jié)構(gòu)和活性
Ｆｉｇ．１ ＳｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＮＶｐｒｏｔｅａｓｅ
ａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
２．２ 不同ｐＨ 值時(shí) ＮＶ 蛋白酶 二 級 結(jié) 構(gòu) 和 活 性
在ｐＨ 值１～１０范圍內(nèi)，ＮＶ 蛋白酶活性與 ｐＨ 值
呈正相關(guān)關(guān)系 （ｒ＝０．９２４，Ｐ＜０．０１）。ＮＶ 蛋白酶
α－螺旋結(jié) 構(gòu) 比 率 和 β－折 疊 結(jié) 構(gòu) 比 率 呈 波 動(dòng) 變 化；
α－螺 旋結(jié) 構(gòu) 比 率 與 ｐＨ 值 無 相 關(guān) 性 （Ｐ＞０．０５），
而與活性呈正相關(guān)關(guān)系 （ｒ＝０．７２１，Ｐ＜０．０１）；
ＮＶ 蛋白酶β－折疊結(jié)構(gòu)比率與ｐＨ 值和活性均無相
關(guān)性 （Ｐ＞０．０５）。見圖２。
２．３ ＮＶ 蛋白酶的凍干過程 在預(yù)凍階段內(nèi)溫 度
下降曲線與隔板溫度下降曲線基本保持一致，只是
其 斜 率 略 低。 在 第 一 干 燥 階 段， 樣 品 溫 度
（Ｃｕｒｖｅ１）隨隔板升溫而升溫，隔板溫度（Ｃｕｒｖｅ２）
達(dá)到預(yù)定溫度后基本維持不變，而樣品溫度波動(dòng)較
大，１０．５ｈ后樣 品 溫 度 波 動(dòng) 幅 度 逐 漸 縮 小。在 第
二干燥階段，樣品溫度隨隔板上升斜率較*干燥
階段有所提高，隔板溫度達(dá)到預(yù)定溫度后基本維持
不變，而樣 品 溫 度 有 小 幅 波 動(dòng)，２２ｈ后樣 品 溫 度
逐漸接近隔板溫度。在*和第二干燥階段，冷凝
器溫 度 （Ｃｕｒｖｅ３）基 本 維 持 在 －４５℃ ～ －４０℃，
冷凝器在第二干燥階段溫度波動(dòng)比*干燥階段明
顯減少。在 預(yù) 凍 階 段 內(nèi)，凍 干 倉 壓 力 （Ｃｕｒｖｅ４）
下降 迅 速。在 第 一 干 燥 階 段 的 初 始 階 段 （４．０～
７．５ｈ），凍干倉壓力隨隔板升溫而提高；在中間階
段（７．５～１２．０ｈ），凍干倉壓力波動(dòng)較大，與 樣 品
溫度波 動(dòng) 有 一 定 的 一 致 性；在 結(jié) 尾 階 段 （１２．０～
１３．５ｈ），凍干倉壓力波動(dòng)漸趨平靜。在 第 二 干 燥
階段，凍干倉壓力在小幅上升后，逐漸下降，與樣
品溫度變化趨勢相反。見圖３。
圖２ 不同ｐＨ 值時(shí) ＮＶ 蛋白酶二級結(jié)構(gòu)與活性
Ｆｉｇ．２ ＳｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＮＶｐｒｏｔｅａｓｅ
ａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｖａｌｕｅｓ
Ｃｕｒｖｅ １：Ｓａｍｐｌｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｃｕｒｖｅ ２：Ｈｅａｔｅｒ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；
Ｃｕｒｖｅ３：Ｃｏｏｌｅｒ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｃｕｒｖｅ ４：Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ
ｐｒｅｓｓｕｒｅ．
圖３ ＮＶ 蛋白酶的凍干曲線
Ｆｉｇ．３ ＬｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆＮＶｐｒｏｔｅａｓｅ
２．４ＮＶ 蛋白酶不同平均冷凍速率時(shí)凍干品復(fù)溶后
濁度和活性 ＮＶ 蛋白酶凍干品復(fù)溶后濁度隨平均
冷凍速率的上升而明顯上升，ＮＶ 蛋白酶凍干品復(fù)
溶后活性隨平均冷凍速率的上升而緩慢下降。
見圖４。
張連芝，等 ． ＮＶ 蛋白酶凍干工藝的相關(guān)技術(shù)參數(shù) ８１３
２．５ 不同濃 度 Ｔｗｅｅｎ８０條件 下 ＮＶ 蛋白 酶 凍 干
品復(fù)溶活性和濁度 添加０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０后各
冷凍速率組 （２．０、２．５和３．０ ℃·ｍｉｎ－１）ＮＶ 蛋
白酶活 性 明 顯 增 加 （圖 ５）。添加 ０．０１５％ Ｔｗｅｅｎ
８０后各冷 凍 速 率 組 （２．０、２．５和３．０℃·ｍｉｎ－１）
ＮＶ 蛋白酶濁度明顯降低。見圖６。
圖４ 不同平均冷凍速率時(shí) ＮＶ 蛋白酶濁度和活性
Ｆｉｇ．４ Ｔｕｒｂｉｄｉｔｉｅｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＮＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｖｅｒａｇｅｆｒｅｅｚｉｎｇｒａｔｅｓ
圖５ 添加不同濃度 Ｔｗｅｅｎ８０后 ＮＶ 蛋白酶的活性
Ｆｉｇ．５ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆ ＮＶ ｐｒｏｔｅａｓｅａｆｔｅｒａｄｄｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＴｗｅｅｎ８０
圖６ 添加不同濃度 Ｔｗｅｅｎ８０后 ＮＶ 蛋白酶的濁度
Ｆｉｇ．６ Ｔｕｒｂｉｄｉｔｉｅｓｏｆ ＮＶ ｐｒｏｔｅａｓｅａｆｔｅｒａｄｄｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＴｗｅｅｎ８０
３ 討 論
干燥過程是藥品生產(chǎn)環(huán)節(jié)中成本zui高的，而蛋
白藥物的凍干又是所有藥品干燥過程中zui為昂貴
的。蛋白藥物的凍干過程伴隨著蛋白變性，復(fù)溶后
蛋白藥物能否保證充分的溶解度和活性是凍干工藝
研究的關(guān)鍵。
蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是確定蛋白藥物的凍干工藝的
重要數(shù)據(jù)，凍干過程中勢必出現(xiàn)由溫度的降低導(dǎo)致
的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化［７－８］。蛋白的 緩 沖 溶 液 組 成
成分的溫度－溶解 度 曲 線 差 別 較 大，凍 干 過 程 中 同
樣產(chǎn)生 由 ｐＨ 的改變導(dǎo)致的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變
化［９］。由于 ＮＶ 蛋白酶純化和保存緩沖體系是ｐＨ
值為 ７．３ 的 Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４，Ｎａ２ＨＰＯ４ 的溶
解度隨溫度下降而降低，ＮＶ 蛋白酶在凍干的初始
階段勢必會(huì)經(jīng)過溫度和ｐＨ 值降低的雙重過程。蛋
白結(jié)構(gòu)是維持其活性的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)現(xiàn)有的儀
器條件首先研究了溫度、ｐＨ 值對 ＮＶ 蛋白酶二級
結(jié)構(gòu)和活性的影響。本研究結(jié)果顯示：α－螺旋結(jié)構(gòu)
是維持 ＮＶ 蛋白酶在不同溫度條件下的主要結(jié)構(gòu)構(gòu)
象，在低溫條件下所維持的結(jié)構(gòu)比率高于其在高溫
條件下所 維 持 的 結(jié) 構(gòu) 比 率，而 且 α－螺旋 結(jié) 構(gòu) 比 率
變化與ｐＨ 值變化不相關(guān)。因此，ＮＶ 蛋白酶具有
一定的抵抗凍干過程中溫度和ｐＨ 值降低的能力。
平均冷凍速率是降低凍干藥品生產(chǎn)時(shí)間成本的
關(guān)鍵［１０］。本研 究 結(jié) 果 顯 示：ＮＶ 蛋白酶凍干品復(fù)
溶后濁度隨平均冷凍速率的上升而明顯上升，表明
ＮＶ 蛋白酶在凍干過程中存在蛋白表面變性。蛋白
表面變性是蛋白冷凍變性的重要組成；與急速冷凍
相比，慢速冷凍所形成的冰－液界面相對面積較小，
因此慢速冷凍的蛋白產(chǎn)品比急速冷凍產(chǎn)品的濁度明
顯降低［１１－１２］。此外，本文作者還發(fā)現(xiàn)：ＮＶ 蛋白酶
凍干品復(fù)溶后活性隨平均冷凍速率的上升而緩步下
降，該結(jié) 果 與 Ｓａｒｃｉａｕｘ等［１２］和 Ｓｔｒａｍｂｉｎｉ等［１３］研
究結(jié)果一致。Ｓｔｒａｍｂｉｎｉ等［１３］研究發(fā)現(xiàn)：冷凍過程
伴隨蛋白質(zhì)天然折疊的解開和二級、三級結(jié)構(gòu)的破
壞，但這 一 過 程 是 部 分 可 逆 的。 本 文 作 者 研 究
Ｔｗｅｅｎ８０ 作 為 凍 干 變 性 防 護(hù) 劑 的 可 能 性 發(fā) 現(xiàn)：
Ｔｗｅｅｎ８０能夠明顯提高 ＮＶ 蛋白酶復(fù)溶活性和溶
解度，０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０可以作為平衡 ＮＶ 蛋白酶
復(fù)溶 活 性 和 溶 解 度 的 權(quán) 宜 濃 度；平 均 冷 凍 速 率
２．０℃·ｍｉｎ－１可以作為降低凍干藥品生產(chǎn)時(shí)間成
本 的 權(quán) 宜 冷 凍 速 率 參 數(shù)。 本 研 究 結(jié) 果 可 以 與
Ｃｈａｎｇ等［１１］研究結(jié)果相互印證。
Ｔｗｅｅｎ８０是非離子型表面活性劑。研究［１４］發(fā)
現(xiàn)：離子型表面活性劑容易使蛋白變性，而非離子
型表面活性劑通常不導(dǎo)致蛋白 變 性。Ｔｗｅｅｎ２０和
Ｔｗｅｅｎ８０是蛋白制劑中廣為使用的表面活性穩(wěn)定
８１４ 吉林大學(xué)學(xué)報(bào) （醫(yī)學(xué)版） 第４３卷 第１期 ２０１７年１月
劑，過氧化物是 Ｔｗｅｅｎ２０和 Ｔｗｅｅｎ８０的主 要 污
染 物［１５］。Ｋｎｅｐｐ 等［１６］ 研 究 發(fā) 現(xiàn)：Ｔｗｅｅｎ２０ 和
Ｔｗｅｅｎ８０ 的過 氧 化 物 可 以 導(dǎo) 致 蛋 白 的 氧 化 降 解。
因此，目前 Ｔｗｅｅｎ８０作為 ＮＶ 蛋白酶凍干變性防
護(hù)劑的研 究 尚 缺 少 Ｔｗｅｅｎ８０ 的 過 氧 化 物 含 量 和
ＮＶ 蛋白酶降解的檢測。此 外，由 于 Ｔｗｅｅｎ８０對
蛋 白 的 圓 二 色 譜 干 擾 較 大， 未 能 獲 得 添 加
Ｔｗｅｅｎ８０ 的 ＮＶ 蛋白酶圓二色譜數(shù)據(jù)。
綜上所述，ＮＶ 蛋白酶具有一定的抵抗凍干過
程中溫度和ｐＨ 降低的能力，ＮＶ 蛋白酶復(fù)溶活性
和 溶 解 度 受 平 均 冷 凍 速 率 的 影 響。０．０１％
Ｔｗｅｅｎ８０ 和２．０℃·ｍｉｎ－１平均冷凍速率是 ＮＶ 蛋
白酶生產(chǎn)性凍干的有效技術(shù)選擇。
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ｗｈｉｌｅ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ
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