PCR疑難問(wèn)題：熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定性及定量分析。目前它主要通過(guò)兩種方式——熒光染料或者熒光標(biāo)記的探針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。

熒光定量PCR，qPCR

熒光染料法

在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量熒光染料，該染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，并不與單鏈DNA鏈結(jié)合，而且在游離狀態(tài)不發(fā)出熒光，只有摻入DNA雙鏈中才可以發(fā)光，因此，在PCR體系中，隨著特異性PCR產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。

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EvaGreen、SolisGreen、SYBR染料

熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現(xiàn)在丨常用的SYBR GreenⅠ,EvaGreen、SolisGreen屬于飽和熒光染料。非飽和熒光染料在濃度高的時(shí)候會(huì)對(duì)PCR過(guò)程產(chǎn)生抑制，所以在熒光定量實(shí)驗(yàn)時(shí)使用濃度稍低，染料不能占據(jù)DNA雙鏈上的所有位置。當(dāng)PCR隨著溫度上升，雙鏈逐漸解鏈，染料會(huì)從已解開的單鏈上脫落，然后結(jié)合到臨近的尚未解鏈的雙鏈中去繼續(xù)發(fā)熒光。這種染料重排導(dǎo)致在較小的溫度變化內(nèi)，雖然DNA雙鏈的解鏈過(guò)程不同，但熒光值是幾乎不變的，也就是說(shuō)，其溶解曲線不能精確反應(yīng)雙鏈的解鏈情況。

所以，對(duì)于非飽和染料，其溶解曲線分辨率相對(duì)較低，只能區(qū)分特異性的產(chǎn)物，不能分辨單堿基的差異。飽和熒光染料在DNA雙鏈中所有可結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)都會(huì)有染料分子存在，染料與DNA的結(jié)合呈飽和狀態(tài)，隨著溫度上升，在雙鏈解鏈、染料脫離過(guò)程中，未解鏈的雙鏈部分不存在染料可以結(jié)合的位點(diǎn)，染料不能發(fā)生重排。所以使用飽和染料制作的溶解曲線分辨率很高，可以精確反映DNA雙鏈隨著溫度的解鏈情況，精度可以達(dá)到單堿差異的區(qū)分。

熒光標(biāo)記的探針?lè)?/span>

PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)， 探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR 儀檢測(cè)不到熒光信號(hào)； PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），Taq 酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCR 產(chǎn)物形成*同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。

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染料法VS探針?lè)?/span>

1.探針?lè)ㄍㄟ^(guò)探針可以增加反應(yīng)收集信號(hào)的特異性，只有探針結(jié)合的片段上發(fā)生擴(kuò)增才能收集到信號(hào)，探針?lè)軌蛴枚嘀伢w系反應(yīng)，能夠預(yù)測(cè)和提前進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，缺點(diǎn)是要合成探針，成本高

2.染料法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，可以做溶解曲線，分析全部PCR產(chǎn)物的TM值，缺點(diǎn)就是特異性沒(méi)有探針?lè)ê?/span>

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