BellBrook 艾美捷Transcreener 檢測(cè)試劑盒案例展示

BellBrook 艾美捷Transcreener 檢測(cè)試劑盒用于藥物發(fā)現(xiàn)的穩(wěn)健、可重復(fù)、易于使用的酶活性測(cè)定。通過(guò)直接檢測(cè)酶促反應(yīng)的常見產(chǎn)物，例如激酶的 ADP，Transcreener 提供了一種可用于整個(gè)目標(biāo)家族的通用方法。其他通用測(cè)定方法引入了多個(gè)耦合步驟，產(chǎn)生了更多的干擾，從而提供了假陽(yáng)性和假陰性。直接檢測(cè)和遠(yuǎn)紅熒光讀數(shù)可限制干擾，產(chǎn)生準(zhǔn)確的結(jié)果，加速藥物發(fā)現(xiàn)。

自 2006 年推出以來(lái)，Transcreener 激酶檢測(cè)試劑盒已在數(shù)百萬(wàn)個(gè)孔中用于 HTS 和先導(dǎo)發(fā)現(xiàn)。

BellBrook 艾美捷Transcreener 檢測(cè)試劑盒案例展示：

1、使用 Transcreener 激酶檢測(cè)試劑盒發(fā)現(xiàn) IRAK4 抑制劑

Genentech 使用 Transcreener Kinase Assay Kit 發(fā)現(xiàn) IRAK4 抑制劑——IRAK也稱為 Interluekin-1 Receptor Associated Kinase。該組中有四種不同的蛋白質(zhì)，包括 IRAK1、IRAK2、IRAK3 和 IRAK4。這些中的每一個(gè)都介導(dǎo)與 MyD88 及其相關(guān)銜接蛋白的相互作用。IRAK1 和 IRAK4 是具有激酶活性的活性酶，而 IRAK3 通常被認(rèn)為是無(wú)活性的。IRAK2 曾被認(rèn)為是無(wú)活性的，但研究表明其激酶活性對(duì) TLR 信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要。

由于上游 toll 樣受體激活 IRAK4，它使 IRAK1 磷酸化。IRAK1 然后通過(guò)其激酶活性自磷酸化并激活下游底物。該級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致 MAPK 和 NF-κB 的激活以及促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。2進(jìn)一步的研究支持將 IRAK4 作為先天免疫靶點(diǎn)。在這些研究中，IRAK1 基因敲除小鼠在遭受“實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎"時(shí)幾乎沒(méi)有或沒(méi)有炎癥。3還發(fā)現(xiàn)具有 IRAK4 突變的患者存在促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的問(wèn)題。

調(diào)節(jié) IRAK4 的化合物為小分子藥物治療炎癥和免疫疾病提供了潛在途徑。與 IRAK4 相關(guān)的一些疾病包括癌癥、狼瘡、炎癥性腸病、關(guān)節(jié)炎和糖尿病。

在藥物發(fā)現(xiàn)中使用激酶檢測(cè)試劑盒

在最近發(fā)布的zhuanli中，Genentech討論了它如何使用Transcreener Kinase Assay Kit 來(lái)測(cè)量酶活性并確定各種化合物的 Ki 值。總之，使用合成的 IRAK1 肽作為底物測(cè)試了 IRAK4 測(cè)定條件。將樣品孵育 90 分鐘，達(dá)到目標(biāo) 10% 的 ATP 轉(zhuǎn)化為 ADP。該測(cè)定的敏感性使研究人員能夠使用低 nM 濃度的 IRAK4 (1.25 nM)。還使用先前討論的相同合成肽底物測(cè)量了 IRAK1 活性。還使用 10% 的轉(zhuǎn)化率，起始 ATP 濃度為 62.5 uM。然后在 Tecan M1000 讀板機(jī)上讀取化驗(yàn)結(jié)果，隨后分析數(shù)據(jù)。舉例說(shuō)明了納摩爾抑制劑的例子。

使用激酶測(cè)定試劑盒測(cè)量酶活性對(duì)于在高通量篩選過(guò)程中尋找新的抑制劑至關(guān)重要。檢測(cè)必須足夠穩(wěn)健，可以在大屏幕上處理數(shù)小時(shí)，但又必須足夠準(zhǔn)確，以提供可靠、可重復(fù)的數(shù)據(jù)和良好的靈敏度。正如基因泰克所說(shuō)明的那樣，后續(xù)的 SAR 對(duì)于構(gòu)建正確的化合物集以在臨床上進(jìn)行治療至關(guān)重要。像 Transcreener 這樣的生化激酶檢測(cè)試劑盒是發(fā)現(xiàn)新抑制劑并將其固化為先導(dǎo)化合物的關(guān)鍵組件。IRAK4 是一個(gè)引人注目的先天免疫靶點(diǎn)，看看臨床試驗(yàn)如何發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的潛在治療方法將會(huì)很有趣。

2、研究人員使用 Transcreener ATPase Assay 驗(yàn)證 Hsp70 活性

正在研究新表達(dá)的人類 Hsp70 活性——熱休克蛋白 70 (Hsp70) 以在壓力期間上調(diào)以維持體內(nèi)平衡而聞名。與其他熱休克蛋白一樣，Hsp70 是一種伴侶蛋白，可幫助其他蛋白質(zhì)正確折疊成為*活躍的分子。它與受損、錯(cuò)誤折疊或部分折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，使它們無(wú)助，直到時(shí)機(jī)成熟；在其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊的作用的情況下，壓力已經(jīng)過(guò)去或形成*合成的蛋白質(zhì)。但是，這還不是全部。除了保護(hù)細(xì)胞和保持其他蛋白質(zhì)的完整性外，Hsp70 通過(guò)阻斷 procaspase-9 向凋亡復(fù)合體的募集來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。通常，這些細(xì)胞存活機(jī)制是保持我們健康所必需的。然而，由于同樣重要的細(xì)胞功能，熱休克蛋白會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病和癌癥。

Hsp70 ATP酶活性

Hsp70 具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域。在其自然狀態(tài)下，它與 ATP 結(jié)合；然而，當(dāng)需要通過(guò)不允許錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集來(lái)保護(hù)細(xì)胞時(shí)，它會(huì)釋放 ATP 并與 ADP 結(jié)合；ATP酶活性增加。當(dāng)與 cochaperone、熱休克蛋白 40 (Hsp40) 相互作用時(shí)，活性增加得更多。1,2,3 Hsp40 蛋白具有多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (PPD)，能夠?qū)⒍喾N其他分子結(jié)合并遞送至 Hsp70。1在 ATP 釋放期間，Hsp70 上的構(gòu)象變化允許錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合。同樣，一旦 ADP 被釋放并且 ATP 再次結(jié)合，部分折疊的蛋白質(zhì)就能夠自由移動(dòng)。

生產(chǎn)全長(zhǎng)和活性人 Hsp70

由于我們目前對(duì) Hsp70 的了解來(lái)自大腸桿菌同源物，其共享約 50% 的氨基酸同一性，Marcion 等人。很高興能創(chuàng)造出重組全長(zhǎng)人類熱休克蛋白 70 (hHsp70)。2BellBrook 的 Transcreener® Assay技術(shù)使研究人員能夠在純化后確認(rèn)其功能。驗(yàn)證功能非常重要。該蛋白質(zhì)必須具有活性才能進(jìn)一步研究并可能找到一種抑制劑來(lái)對(duì)抗過(guò)量 Hsp70 的負(fù)面影響。該測(cè)定表明，當(dāng)與人 Hsp40 結(jié)合時(shí)，Hsp70 活性增加，就像它在體內(nèi)一樣。

對(duì)于那些有興趣研究 hHsp70 和尋找治療分子來(lái)幫助那些患有癌癥和/或神經(jīng)退行性疾病的人來(lái)說(shuō)，這一發(fā)現(xiàn)是令人振奮的消息。

以上就是兩個(gè)有關(guān)于BellBrook 艾美捷Transcreener 檢測(cè)試劑盒的成功案例。

BellBrook致力于蛋白質(zhì)靶標(biāo)的高通量篩選工具，助力制藥和生物技術(shù)公司、CRO 和學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室加速藥物發(fā)現(xiàn)。Transcreener 高通量篩選 (HTS) 平臺(tái)，可以提供的直接檢測(cè)有：ADP2，AMP2/GMP2，GDP，UDP2等檢測(cè)。艾美捷科技是BellBrook的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。