蛋氨酸含量高效測定工具--蛋氨酸檢測試劑盒

蛋氨酸是一種動物必需的氨基酸，因此必須通過飲食來源獲取。在雞蛋、肉類、魚類以及芝麻、巴西果仁和其他一些植物種子中可以檢測到高含量的蛋氨酸。大多數(shù)水果和蔬菜中蛋氨酸含量較低。除了在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中的傳統(tǒng)作用外，蛋氨酸還作為合成其他氨基酸（如半胱氨酸和?；撬幔┮约爸匾目寡趸瘎┕入赘孰牡耐緩街械牡孜铩５鞍彼釋θ祟惡驮S多其他物種的代謝至關(guān)重要。蛋氨酸在血管生成過程中發(fā)揮重要作用，血管生成是新血管的生長過程。補充蛋氨酸可能對銅中毒有益。然而，許多研究表明，攝入過多的蛋氨酸與癌癥生長有關(guān)。

Cell Biolabs的蛋氨酸檢測試劑盒是一種簡單的熒光法檢測，用于在96孔微量滴定板格式中測量生物樣本中總蛋氨酸的含量。每個試劑盒提供足夠的試劑，可進(jìn)行多達(dá)100次檢測（包括空白、蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣本）。通過與已知濃度的蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品比較來確定樣本中的蛋氨酸濃度。該試劑盒的檢測靈敏度為1.5 µM蛋氨酸。

注意：每個樣本重復(fù)需要2次檢測，一次用S-腺苷蛋氨酸合成酶（+AdoMetS）處理，一次不處理（-AdoMetS）。通過計算兩個孔的相對熒光單位（RFU）讀數(shù)的差異來計算蛋氨酸含量。

艾美捷蛋氨酸檢測試劑盒（#MET-5158）檢測原理：

Cell Biolabs的蛋氨酸檢測試劑盒通過測量生物樣本中的總蛋氨酸含量。蛋氨酸和ATP在S-腺苷蛋氨酸合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為S-腺苷蛋氨酸、無機磷酸鹽和焦磷酸鹽。磷酸烯醇丙酮酸和焦磷酸鹽在磷酸丙酮酸二激酶的作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸。丙酮酸在丙酮酸氧化酶的作用下，在磷酸鹽和氧氣的存在下轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸、二氧化碳和過氧化氫。隨后通過高特異性的熒光探針檢測生成的過氧化氫。辣根過氧化物酶催化探針與過氧化氫之間的反應(yīng)，它們以1:1的比例結(jié)合。樣本與已知濃度的蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在96孔微量滴定板格式中進(jìn)行比較。樣本和標(biāo)準(zhǔn)品孵育30分鐘后，使用標(biāo)準(zhǔn)的96孔熒光平板讀數(shù)器進(jìn)行讀?。▓D1）。

圖1. 蛋氨酸檢測原理

蛋氨酸檢測試劑盒組分：

盒子1（干冰運輸）

1. 蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（部件編號51581C）：1支50 µL試管，濃度為10 mM。

2. ATP（部件編號51583C）：1支50 µL試管，腺苷三磷酸（ATP）濃度為200 mM。

3. AMP（部件編號51584C）：1支50 µL試管，腺苷單磷酸（AMP）濃度為20 mM。

4. PEP（部件編號51585C）：1支50 µL試管，磷酸烯醇丙酮酸（PEP）濃度為100 mM。

5. 熒光探針（部件編號50231C）：1支50 µL試管，溶劑為DMSO。

6. HRP（部件編號234402-T）：1支10 µL試管，100 U/mL的甘油溶液。

7. FAD（部件編號50293C）：1支50 µL試管，黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）濃度為2 mM。

8. TPP（部件編號50294C）：1支50 µL試管，硫胺素焦磷酸（TPP）濃度為2 mM。

9. 丙酮酸氧化酶（部件編號50295C）：1支300 µL試管。

10. AdoMetS（部件編號51587D）：1支150 µL試管，S-腺苷蛋氨酸合成酶（AdoMetS）。

11. PPDK（部件編號51588D）：1支200 µL試管，磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）。

盒子2（干冰運輸）

1. 10X檢測緩沖液（部件編號51582A）：1瓶25 mL。

2. Na?HPO?（部件編號51586A）：1支50 µL試管，磷酸氫二鈉（Na?HPO?）濃度為100 mM。

未提供材料：

1. 蒸餾水或去離子水

2. 10 kDa分子量截止（MWCO）離心過濾器（例如Amicon Ultra 0.5 mL）

3. 標(biāo)準(zhǔn)96孔黑色熒光微量滴定板和/或黑色細(xì)胞培養(yǎng)微量滴定板

儲存：

將10X檢測緩沖液和Na?HPO?在室溫下保存。將AdoMetS和PPDK在-80oC下保存。將所有其他組分在-20oC下保存。熒光探針對光敏感，必須相應(yīng)保存。避免多次凍融循環(huán)。

樣本準(zhǔn)備：

- 細(xì)胞培養(yǎng)上清液：應(yīng)避免使用含有丙酮酸的細(xì)胞培養(yǎng)基。為了去除不溶性顆粒，以10,000 rpm離心5分鐘。收集上清液，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白。收集濾液。濾液可以直接用于檢測，或根據(jù)需要稀釋到PBS中。

  注意：維持pH在7到8之間以獲得最佳工作條件，因為熒光探針在高pH（>8.5）下不穩(wěn)定。

- 組織裂解液：在PBS中超聲或勻漿組織樣本，并在4°C下以10,000 x g離心10分鐘。收集上清液，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白。收集濾液。濾液可以直接用于檢測，或根據(jù)需要稀釋到PBS中。

- 細(xì)胞裂解液：將細(xì)胞重懸于PBS中。在冰上勻漿或超聲處理細(xì)胞。離心去除雜質(zhì)。收集上清液，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白。收集濾液。濾液可以未稀釋或根據(jù)需要稀釋到PBS中用于檢測。

- 血清、血漿、唾液或尿液：為了去除不溶性顆粒，以10,000 rpm離心5分鐘。收集上清液，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白。收集濾液。濾液可以直接用于檢測，或根據(jù)需要稀釋到PBS中。

注意事項：

- 所有樣本應(yīng)立即進(jìn)行檢測，或在-80°C下儲存最長1-2個月。根據(jù)需要運行適當(dāng)?shù)膶φ战M。樣本的最佳實驗條件需由研究者自行確定。始終與樣本一起運行標(biāo)準(zhǔn)曲線。

- NADH濃度高于10 µM和谷胱甘肽濃度高于50 µM的樣本會氧化熒光探針，可能導(dǎo)致錯誤的讀數(shù)。為了盡量減少這種干擾，建議在反應(yīng)中加入超氧化物歧化酶（SOD），最終濃度為40 U/mL（參考文獻(xiàn)2）。

- 避免使用含有DTT或β-巰基乙醇的樣本，因為熒光探針在硫醇（高于10 µM）存在時不穩(wěn)定。

相關(guān)產(chǎn)品：

1. MET-5029：丙酮酸檢測試劑盒（熒光法）

2. MET-5001：乳糖檢測試劑盒（熒光法）

3. MET-5013：乳酸檢測試劑盒（熒光法）

4. MET-5023：糖原檢測試劑盒（熒光法）

5. STA-399：游離甘油檢測試劑盒（熒光法）

蛋氨酸檢測試劑盒引用文獻(xiàn)：

1. Finkelstein JD (1990). J. of Nutr. Biochem. 1: 228–37.

2. Votyakova TV, and Reynolds IJ (2001) Neurochem. 79:266.

3. Longchamp A, Mirabella T 2, Arduini A, MacArthur MR, Das A, Trevi?o-Villarreal JH, Hine C,

Ben-Sahra I, Knudsen NH, Brace LE, Reynolds J, Mejia P, Tao M, Sharma G, Wang R, Corpataux

J-M, Haefliger J-A, Ahn KH, Lee C-H, Manning BD, Sinclair DA, Chen CS, Ozaki CK, and

Mitchell JR. (2018) Cell 22:117-129

4. Cavuoto P, Fenech MF (2012). Cancer Treat. Rev. 38: 726–736.

5. Cellarier E, Durando X, Vasson MP, Farges MC, Demiden A, Maurizis JC, Madelmont JC, Chollet

P (2003). Cancer Treat. Rev. 29: 489–499.