脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)試劑盒-衡量病理生理過(guò)程中氧化損傷的有用指標(biāo)

脂質(zhì)過(guò)氧化是一種多種脂質(zhì)分子的非酶促氧化過(guò)程，涉及從碳原子上抽取氫原子并在通常與雙鍵相鄰的碳原子上插入氧分子。這會(huì)破壞脂質(zhì)分子，導(dǎo)致如丙二醛（MDA）或4-羥基壬烯醛（HNE）等產(chǎn)物的形成。這些終產(chǎn)物可能作為信號(hào)分子發(fā)揮作用。檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物是衡量病理生理過(guò)程中氧化損傷的有用指標(biāo)。AkrivisBio的脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)提供了一種高效工具，通過(guò)與硫代ba比妥酸反應(yīng)檢測(cè)MDA，生成在532 nm處有吸收或熒光（激發(fā)/發(fā)射 = 532/553 nm）的生色團(tuán)。

艾美捷脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)試劑盒：

貨號(hào)：MA-0102

規(guī)格：100孔

樣本類型：細(xì)胞或組織裂解液

適用范圍：所有物種

檢測(cè)方法：比色法，OD 532 nm；或熒光法，激發(fā)/發(fā)射 = 532/553 nm

檢測(cè)類型：定量

應(yīng)用：基于微孔板的比色/熒光檢測(cè)，用于測(cè)定樣本中的丙二醛（MDA）水平。

靈敏度：> 0.1 nmol/孔

儲(chǔ)存條件：+4°C

運(yùn)輸溫度：凝膠冰袋

有效期：自發(fā)貨日期起一年

脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理：

1. 破碎組織或細(xì)胞，沉淀蛋白。使用澄清的上清液進(jìn)行分析。

2. 加入硫代ba比妥酸，在95°C孵育60分鐘以形成生色團(tuán)。

脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)試劑盒組成：

檢測(cè)緩沖液：25 ml（WM MA-0102-A）

磷鎢酸溶液：12.5 ml（NM MA-0102-B）

BHT：1 ml（紫色，MA-0102-C）

硫代ba比妥酸（TBA）：4 x 250 mg（NM MA-0102-D）

MDA標(biāo)準(zhǔn)品：100 ul（黃色，MA-0102-E）

用戶自備試劑和設(shè)備：

冰醋酸

具有透明平底的96孔板

烤箱或熱板

酶標(biāo)儀

Eppendorf管或類似容器

儲(chǔ)存和操作：

將試劑盒儲(chǔ)存于4°C。使用前將所有試劑恢復(fù)至室溫。打開前短暫離心試劑瓶。在進(jìn)行檢測(cè)前，請(qǐng)仔細(xì)閱讀整個(gè)操作步驟。進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)，請(qǐng)使用黑色或白色板。

試劑配制：

向一管硫代ba比妥酸中加入7.5 ml冰醋酸（用戶自備），混合均勻。將漿液轉(zhuǎn)移到另一管中，并加去離子水至最終體積25 ml。充分混合以溶解。如有必要，可超聲以助溶解。配制好的溶液可在4°C下保存長(zhǎng)達(dá)1周。

檢測(cè)步驟：

1. 樣本準(zhǔn)備：

將10 mg組織或1×10?細(xì)胞在冰上用300 ul MDA裂解緩沖液+3 ul BHT進(jìn)行勻漿。離心（13,000 X g，3-5分鐘）以沉淀不溶性物質(zhì)?；蛘?，將樣本在150 ul去離子水+3 ul BHT中勻漿以沉淀蛋白。加入150 ul 2 N高氯酸，渦旋，離心以去除蛋白。將200 ul上清液轉(zhuǎn)移到微量離心管中。

對(duì)于血漿：在微量離心管中將20 ul血漿與500 ul 42 mM H?SO?（用戶自備）混合。加入125 ul磷鎢酸溶液，渦旋。靜置5分鐘，然后以13,000 x g離心1分鐘。收集沉淀，并在冰上用100 ul去離子水+2 ul BHT重懸。用去離子水調(diào)整最終體積至200 ul。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)備：

用407 ul去離子水稀釋10 ul MDA標(biāo)準(zhǔn)品，制備0.1 M MDA溶液。用980 ul去離子水稀釋20 ul 0.1 M MDA溶液，制備2 mM MDA標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)于比色分析，將0、2、4、6、8、10 ul 2 mM MDA標(biāo)準(zhǔn)品分別加入不同的微量離心管中，并用去離子水調(diào)整體積至200 ul。對(duì)于熒光分析，將2 mM MDA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10倍（10 ul + 90 ul去離子水）。將0、2、4、6、8、10 ul 0.2 mM MDA標(biāo)準(zhǔn)品分別加入不同的微量離心管中，并用去離子水調(diào)整體積至200 ul。

3. 顯色反應(yīng)：

向含有標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的每個(gè)試管中加入600 ul TBA試劑。在95°C下孵育60分鐘以完成顯色反應(yīng)。在冰浴中冷卻至室溫10分鐘。從每個(gè)反應(yīng)混合物中取200 ul加入96孔微孔板進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：比色法：0 5 nmol；熒光法：0 0.5 nmol MDA。對(duì)于血漿：與300 ul正丁醇和100 ul 5 M NaCl混合；渦旋；離心（3分鐘，16,000g，室溫）；將正丁醇（上層）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并使用熱（55°C）和/或真空蒸發(fā)正丁醇。將剩余物質(zhì)在200 ul去離子水中重懸。充分混合后，加入200 ul至96孔黑色板中。

偶爾，樣本會(huì)出現(xiàn)渾濁，可以使用0.2 um濾膜去除。TBA會(huì)與樣本中的其他化合物反應(yīng)生成其他有色化合物。這些化合物通常不會(huì)干擾TBA-MDA加合物的定量。

注意：為了提高靈敏度，向800 ul反應(yīng)混合物中加入300 ul正丁醇（用戶自備），以提取生色團(tuán)。如果沒(méi)有分層，加入100 ul 5 M NaCl并劇烈渦旋。通過(guò)離心（3分鐘，16,000g，室溫）分離各層。轉(zhuǎn)移并蒸發(fā)正丁醇，將生色團(tuán)溶解在200 ul去離子水中，然后在96孔微孔板中讀取。

4. 測(cè)量：

對(duì)于比色分析，讀取532 nm處的吸光度。

對(duì)于熒光分析，使用激發(fā)/發(fā)射 = 532/553 nm讀取上清液。

5. 計(jì)算：

從所有讀數(shù)中減去0 MDA標(biāo)準(zhǔn)品的值。繪制MDA標(biāo)準(zhǔn)曲線。斜率定義了OD/nmol。將斜率應(yīng)用于背景校正后的樣本讀數(shù)。對(duì)樣本值進(jìn)行校正，以考慮樣本制備過(guò)程中進(jìn)行的任何其他稀釋。

樣本羥脯氨酸濃度 = [(A/(mg或ml)] x 4 x D = nmol/ml或nmol/mg

其中：A：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的樣本中MDA的量（以nmol計(jì)）。

mg：使用的原始組織量

ml：使用的原始血漿體積

4：使用800 ul反應(yīng)混合物中的200 ul進(jìn)行校正

D：稀釋因子（用于準(zhǔn)備原始樣本）