流式細(xì)胞術(shù)是非常讓人著迷的實(shí)驗(yàn)。在眾多醫(yī)學(xué)研究手段里，如果說弱水三千只取一瓢的話，那我會(huì)選流式細(xì)胞術(shù)。從我個(gè)人感受來講，流式細(xì)胞術(shù)高速客觀，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，能夠處理復(fù)雜樣本并同時(shí)獲取多種參數(shù)，zuizui關(guān)鍵的是它性能可靠，可重復(fù)性非常好。

 

雖然也存在一些局限，但流式細(xì)胞術(shù)比起傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)研究手段來講*可以獲得「獨(dú)孤求敗」的桂冠了；如果算上共聚焦和膜片鉗，當(dāng)真可以算拉動(dòng)現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的「三駕馬車」了。

 

 

雖然介紹流式細(xì)胞術(shù)的入門文章很多，很多同學(xué)也對(duì)流式細(xì)胞術(shù)耳濡目染已久，看師兄師姐做過無數(shù)，可真到自己做的時(shí)候卻又總出問題。據(jù)毛老師多年觀察，很多同學(xué)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)候就埋下了隱患，zui常見的問題就是對(duì)照設(shè)置不合理，zui后導(dǎo)致整體實(shí)驗(yàn)失敗或數(shù)據(jù)不理想。因此，今天我們來談?wù)劤晒Φ牧魇郊?xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都需要設(shè)置哪些對(duì)照。

 

毫不夸張地說，設(shè)置合理的對(duì)照組是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵；反過來說，如果你掌握了流式實(shí)驗(yàn)如何設(shè)置對(duì)照的精髓，對(duì)整個(gè)免疫學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都會(huì)有極大地幫助。

 

流式對(duì)照至少有 5 種：生物學(xué)對(duì)照，空白對(duì)照，同型對(duì)照（Isotype control），補(bǔ)償對(duì)照（也叫單陽性對(duì)照）和 FMO 對(duì)照，主要目的是為了避免出現(xiàn)的假陽性或假陰性結(jié)果。下面我們以一個(gè)具體的凋亡實(shí)驗(yàn)來看看如何設(shè)置對(duì)照組。下圖是 Annexin V/PI 檢測(cè)凋亡的原理示意圖。

 

 

 

比如有兩組細(xì)胞，一組給予藥物處理（Treat 組），一組給予 DMSO 溶劑（Vehicle 組），擬用 Annexin V/PI 檢測(cè)凋亡，我們來看看都需要設(shè)置哪些對(duì)照。

 

1

 

生物學(xué)對(duì)照

 

這個(gè)很容易理解，也是很多同學(xué)zui早設(shè)立的對(duì)照。這里 Vehicle 組就是生物學(xué)對(duì)照組?？赡芎芏嗤瑢W(xué)想象力就局限于此了，有了生物學(xué)對(duì)照就夠了唄，還需要額外對(duì)照嗎？答案是肯定的，別忘了流式細(xì)胞術(shù)也是一種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，下面我們繼續(xù)來設(shè)置對(duì)照。

 

2

 

空白對(duì)照

 

在流式上機(jī)檢測(cè)前，我們還需準(zhǔn)備額外一組細(xì)胞（正?；蛱幚磉^的皆可），什么染料也不加，作為空白對(duì)照。為什么要設(shè)置空白對(duì)照呢？除了陽性熒光信號(hào)之外，我們還需要排除樣本是否自帶熒光背景，所以要用空白對(duì)照來驗(yàn)證在各個(gè)檢測(cè)通道上的信號(hào)是否都是陰性。

 

3

同型對(duì)照（Isotype control）

 

這個(gè)對(duì)照很多同學(xué)都比較陌生。這個(gè)還得從抗體結(jié)構(gòu)說起。大家知道抗體是個(gè) Y 字形的，F(xiàn)ab 區(qū)域是特異性識(shí)別抗原的。在做蛋白免疫印跡時(shí)，只需考慮 Fab 的特異性就可以了，但是細(xì)胞的話稍微有點(diǎn)不同，因?yàn)橛行┘?xì)胞，特別是免疫細(xì)胞（B 細(xì)胞，T 細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等等），它們表面有 Fc 受體，所以這個(gè)同型對(duì)照是為了評(píng)估抗體 Fc 段與靶細(xì)胞的結(jié)合情況。如果還不懂的話請(qǐng)看下圖。

 

 

 

所以在做免疫細(xì)胞的流式檢測(cè)時(shí)，我們通常都需要加入 Fc 受體封閉劑，之后再加入目標(biāo)抗體的 isotype 作為同型對(duì)照，來排除細(xì)胞 Fc 受體造成的假陽性結(jié)果。一般試劑商都會(huì)告知該抗體需要使用哪種同型抗體。

 

 

4

補(bǔ)償對(duì)照（單陽性對(duì)照）

 

要理解這個(gè)對(duì)照，首先需要知道什么是熒光補(bǔ)償。一圖勝前言，下面這個(gè)示意圖說得比較明白。

 

 

簡(jiǎn)單來說，需要使用幾種顏色的抗體，就需要設(shè)置幾種顏色的單陽性對(duì)照。這個(gè)對(duì)照可以用細(xì)胞來做，也可以特殊的微球的來做。這里嚴(yán)重推薦使用補(bǔ)償微球來作為補(bǔ)償對(duì)照，一是能節(jié)約時(shí)間和樣本，二是，有時(shí)候自己做的單陽性對(duì)照效果不佳，陽性信號(hào)不強(qiáng)，就失去了補(bǔ)償對(duì)照的意義了。下圖是我用補(bǔ)償微球的效果。

 

 

5

熒光減一（FMO，F(xiàn)luorescence minus one）對(duì)照

 

如果只用到兩種顏色的話，這個(gè)對(duì)照可以用單陽性對(duì)照代替，如果三種以上顏色的話，就需要再設(shè)置 FMO 對(duì)照來評(píng)估其他熒光染料的干擾和補(bǔ)償本底，幫助正確設(shè)置陽性門。

 

下圖演示如果按空白對(duì)照組設(shè)定界線之后得到的細(xì)胞比例比 FMO 設(shè)定的值要大。從這個(gè)圖可以看出，空白對(duì)照僅僅是設(shè)定陰性界線，但非陰性并不等于就是陽性，所以還需 FMO 來設(shè)定陽性界線。再打個(gè)比方，比如人體體溫正常是 37°，小于 37° 肯定不是發(fā)熱，那超過 37° 就一定是發(fā)熱嗎，比如 37.1°？（發(fā)熱的診斷界線是 37.3°）。

 

 

所以，綜上所述，如果只檢測(cè)兩種顏色的話，至少需要 5 個(gè)對(duì)照（生物學(xué)對(duì)照 + 空白對(duì)照 + 同型對(duì)照 + 2 個(gè)單陽性對(duì)照）。如果要檢測(cè) 3 種顏色的話，我們來算算，生物學(xué)對(duì)照 + 空白對(duì)照 + 同型對(duì)照（可以不同的 isotype 做在同一管里）+3 個(gè)單陽性對(duì)照 + 3 個(gè) FMO 對(duì)照，一共需要 9 個(gè)對(duì)照。

 

 

只有設(shè)置了合理的對(duì)照，才能得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，小伙伴們 get 到了嗎？下次再去做流式，就不會(huì)被流式的老師懟得無地自容了吧。如果覺得對(duì)您有所啟發(fā)，請(qǐng)點(diǎn)個(gè)贊哦，要是感興趣的同學(xué)比較多，我們下次再繼續(xù)談?wù)剺颖咎幚砗皖伾钆涞膯栴}。

 

zui后想提一點(diǎn)冷知識(shí)，流式細(xì)胞術(shù)（Flowcytometry）是近年來流行起來的叫法，但它和 FACS 嚴(yán)格來說不是同一個(gè)意思，F(xiàn)ACS 意思是 Fluorescence activated Cell Sorting，以前老一輩們都叫熒光激發(fā)細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)，S 是分選的意思，但實(shí)際上很多流式細(xì)胞儀還只能做到檢測(cè)分析，不能實(shí)現(xiàn)分選，我們只是習(xí)慣用 FACS 來指代流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)而已。