免疫熒光標記實驗流程（IF）

免疫熒光單標記方法

 

免疫熒光單標記是指只標記一種蛋白質(zhì)分子，方法比較簡單，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會直接影響染色結果。具體染色方法如下。

免疫熒光標記實驗流程（IF）

1、所需材料與試劑

 

a, 培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達到60%-70%的細胞。

 

b, 一抗、FITC或TRITC標記的二抗。

 

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預冷20 min)。

 

d, 封閉液。

 

e, 0.01mol／LPBS緩沖液。

 

2、染色方法

 

a, 取出培養(yǎng)有細胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

 

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

 

c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

 

d，正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min，抑制IgG的非特異性結合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。

 

e, 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃過夜?？贵w以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗而定)。

 

f, 0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain。

 

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

 

h, 0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用濾紙吸干。

 

i, 90%甘油(PBS配制)封片。

 

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。

免疫熒光標記實驗流程（IF）

免疫熒光雙標記方法

 

免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子，當懷疑某種配體與已知受體結合后可用此方法加以證明。此方法稍微復雜一些，首先應注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來自家兔；B抗體為單克隆抗體，來自小鼠)。其次，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應重疊，且盡量遠離，通?？梢赃x擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下，染色時兩種一抗可以同時孵育，然后可以同時孵育兩種二抗。但當染色結果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強時，應考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標記。

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