科技文獻(xiàn)中有很多抗體標(biāo)記方法指南，我們往往難以選擇方法。本指南可以幫助您更好的理解標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)標(biāo)記方法及它們的優(yōu)缺點，同時還介紹了 Lightning-Link一步法抗體標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)極大簡化了抗體標(biāo)記步驟，利用該技術(shù)標(biāo)記抗體不需要您具備太多化學(xué)方面的知識，并且手頭操作時間僅需短短的30秒！

抗體與標(biāo)記物

在多種免疫實驗（流式細(xì)胞術(shù), ELISA, western blotting, 免疫組化等）中，抗體被廣泛應(yīng)用于檢測和定量抗原。直接識別抗原的抗體被稱為一抗（primary antibody），賦予檢測的特異性。大多數(shù)免疫檢測中還需加入標(biāo)記物，賦予實驗可檢測性。標(biāo)記物包括有機染料、熒光蛋白、有色微粒和酶。

直接檢測法 Vs.間接檢測法

包含標(biāo)記物的免疫檢測一般有直接法和間接法兩種形式。直接檢測法中，標(biāo)記物通過共價鍵直接連接到一抗上。而對于間接檢測法，標(biāo)記物則是共價連接到與一抗特異性結(jié)合的二抗上。間接法檢測包括兩步：步，用未標(biāo)記的一抗進(jìn)行孵育，抗體與抗原結(jié)合（若存在抗原），洗去未結(jié)合的抗體（一般3~5次），第二步則是加入標(biāo)記二抗孵育（通常1小時），洗滌去掉未結(jié)合的二抗，然后量化結(jié)合在一抗上的標(biāo)記物。

在直接法中，標(biāo)記物直接與一抗共價結(jié)合，因此僅需與含有抗原的樣本孵育這一步驟，而且只需一次洗滌，而間接法則需要兩輪孵育與洗滌步驟。直接法簡化了試驗的流程，降低了試驗的變異性，增加了數(shù)據(jù)的可靠性。然而一抗的共價修飾可以導(dǎo)致抗體親和力的改變，這種情況的出現(xiàn)與標(biāo)記二抗帶來的非特異性結(jié)合的問題相比而言，顯得無關(guān)緊要。下表列舉出了直接法與間接法的主要優(yōu)缺點比較。

 

表.直接法與間接法的比較

方法	優(yōu)點	缺點
直接法	操作簡單，結(jié)果可靠； 僅需使用一抗，檢測快速； 無二抗的非特異性結(jié)合。	由于標(biāo)記可能導(dǎo)致一抗的免疫反應(yīng)性降低； 信號放大作用較弱。
間接法	一抗含有多個標(biāo)記二抗可結(jié)合的表位，因而靈敏度升高，信號放大作用較強。	二抗可能發(fā)生非特異性結(jié)合； 孵育及洗滌步驟增多。

 

既然直接標(biāo)記法具有很多優(yōu)點，但為何眾多的免疫分析仍采用間接法呢?原因是市場上帶有標(biāo)記的一抗較少，而且直接標(biāo)記一抗較困難，這在過去也許是您的困擾，但是當(dāng)您讀到本篇指南的后時就會對抗體標(biāo)記充滿信心。

 

抗體標(biāo)記方法

您僅需理解基本的化學(xué)原理，哪些基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，根據(jù)化學(xué)結(jié)合物的種類去選擇合適的試劑，而不需要糾結(jié)化學(xué)結(jié)構(gòu)和完整的化學(xué)名稱。抗體和所有蛋白一樣，是由氨基酸殘基組成的。蛋白的氨基基團(tuán)（N-末端及賴氨酸殘基的側(cè)鏈）通常被用于共價鏈接標(biāo)記物。盡管在文獻(xiàn)中報道了多種多樣的標(biāo)記方法和成百上千的化學(xué)修飾試劑，然而實際上只有少數(shù)重要的方法和試劑。無論何種方法，幾乎毫無例外的都是將標(biāo)記物共價連接到抗體分子的賴氨酸殘基上。

以下是幾種主要的抗體標(biāo)記方法：

1.琥珀酰酯 (NHS)法

當(dāng)使用熒光染料標(biāo)記時，通?？少徺I內(nèi)配有NHS琥珀酰酯（也稱為琥珀酰亞胺酯）的活化標(biāo)記物。在適當(dāng)條件下，活化的染料可與抗體分子反應(yīng)（抗體分子通常含有多了賴氨酸基團(tuán)）而形成結(jié)合物。根據(jù)標(biāo)記抗體和游離染料的大小不同，過量的活性染料可通過層析法去掉，純化的步驟會導(dǎo)致一部分標(biāo)記抗體的損失，但是為了避免實驗的高背景，這些純化步驟是必要的。

2.碳二亞胺（Carbodiimides）法

這類試劑（常見的如EDC）在氨基和含羧基的分子間形成共價連接。碳二亞胺活化羧基，活化的中間體隨后被氨基（抗體分子的賴氨酸殘基）吸附。碳二亞胺通常用于連接抗體和羧化的顆粒（如乳膠顆粒、磁珠），以及其他羧化的表面如微孔板。碳二亞胺很少用于將蛋白標(biāo)記物偶聯(lián)到抗體上，因為這兩種分子都含有氨基（賴氨酸）和羧基。大多數(shù)碳二亞胺試劑都不溶于水，因此它們主要用于有機合成化學(xué)，比如生產(chǎn)NHS活性染料。真正用于蛋白/抗體標(biāo)記的碳二亞胺試劑為EDC（也稱為EDAC），常以鹽酸鹽的形式出售。

3.過碘酸鈉（Sodium periodate）法

過碘酸鈉是一種用于活化辣根過氧化物酶的強氧化劑。這種過碘酸鹽與糖鏈反應(yīng)產(chǎn)生能與抗體的賴氨酸殘基反應(yīng)的醛基。由于HRP分子本身含有很少的賴氨酸，因而相對容易獲得抗體-HRP結(jié)合物，且無明顯的HRP多聚化發(fā)生。該方法的缺點是賴氨酸和醛基結(jié)合物的形成是可逆的，只有在硼氫化鈉還原劑的作用下才能穩(wěn)定，然而硼氫化鈉有一定的危險性。

4. 異硫氰酸鹽（Isothiocyanate）法

該方法值得特別一提是因為FITC（異硫氰酸熒光素）的重要意義。FITC作為抗體和蛋白的標(biāo)記物已使用了很多年。異硫氰酸鹽較NHS琥珀酰亞胺酯穩(wěn)定，因此在保存中不易分解，但是與抗體的反應(yīng)性較差。FITC不溶于水，須溶于有機溶劑。該方法的局限性在于反應(yīng)需在PH9.5或更高的條件下進(jìn)行，否則標(biāo)記反應(yīng)會非常緩慢，然而一些單克隆抗體在高PH條件下可能會被破環(huán)。

5.異（基）雙功能試劑 (Heterobifunctional reagents)

當(dāng)標(biāo)記物為蛋白分子（如堿性磷酸酶AP、藻紅蛋白PE）時，由于抗體和標(biāo)記分子都含有大量賴氨酸殘基，因此標(biāo)記流程略為復(fù)雜，可能發(fā)生預(yù)期外的其他反應(yīng)。在這種情況下，通常需要對其中一個分子（如抗體）的一些賴氨酸進(jìn)行修飾，以此創(chuàng)造一個新的反應(yīng)基團(tuán)（X），而標(biāo)記物上的賴氨酸作為另一個反應(yīng)基團(tuán)（Y）。當(dāng)抗體與標(biāo)記物混合時，利用雙功能試劑引入Y基團(tuán)，隨之與X基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而形成異二聚體結(jié)合物（即標(biāo)記抗體）。該方法的主要缺點是標(biāo)記前需要一些分離步驟將X標(biāo)簽結(jié)合到抗體上，這些分離步驟對標(biāo)記反應(yīng)是不利的。

緩沖液及添加物--抗體標(biāo)記的關(guān)鍵因素

抗體溶液中除抗體蛋白分子外，可能還含有少量其他物質(zhì)如緩沖液、鹽、或其他蛋白及添加物。添加物對不同標(biāo)記方法的影響程度不同，但絕大多數(shù)的標(biāo)記抗法都是利用抗體分子上的賴氨酸殘基，因此在標(biāo)記反應(yīng)中應(yīng)避免加入含有伯胺的緩沖液或添加物。有時，標(biāo)記反應(yīng)前需要重新純化抗體，尤其當(dāng)抗體中含有穩(wěn)定蛋白（BSA）或低分子量物質(zhì)（氮化鈉、Tris、甘氨酸）時。甘氨酸和Tris緩沖液常用來純化和中和抗體，后加入氮化物來防止微生物的滋生。純化實驗中常用低PH值的檸檬酸洗脫抗原親和柱上的抗體，然而檸檬酸會對碳化二亞胺參與的反應(yīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。因此，純化過的抗體在標(biāo)記前需要進(jìn)行透析。需要特別注意的是，透析時如能更換2-3次緩沖液，那么去除小分子雜質(zhì)的效率更高。這并不意味著您需要準(zhǔn)備3倍或更大量的緩沖液一次性來透析，恰恰相反，多次透析延長了透析的時間，從而達(dá)到更好的雜質(zhì)去除效果。如用1L的緩沖液透析3次的效果遠(yuǎn)比用5L的緩沖液透析一次的效果好。如果透析后需要加入氮化合物，盡可能使用低的濃度（如0.02%）或者將抗體以濃縮形式保存。例如，在5mg/ml 抗體中加入0.02%氮化物，若后續(xù)標(biāo)記實驗使用1mg/ml 抗體時，氮化物的濃度則降低為0.004%；然而如果將0.1% 氮化物加入0.5 mg/ml抗體溶液中，毫無疑問會對標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。

抗體濃度及純度

大多數(shù)標(biāo)記反應(yīng)對抗體都有一個純度要求（如>90%，>95%）和濃度要求（至少0.5mg/ml）。市售的許多商業(yè)化抗體一般都是適用于標(biāo)記的純化形式，但并非所有情況都如此，有些抗體常以雜交瘤組織培養(yǎng)上清（TCS）、腹水或血清等形式出售。TCS通常含有多種其他蛋白和培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸），這對于標(biāo)記是個非常大的問題。如果您使用的是TCS，那么純化（如過蛋白A柱）步驟則是必需的。腹水和血清原液中的抗體濃度較TCS中的抗體濃度高，但它們同樣也是不純的，含有高濃度的干擾物質(zhì)，進(jìn)一步的純化往往也是必要的。

上述介紹了常用的傳統(tǒng)標(biāo)記方法以及每種方法的優(yōu)勢和劣勢。下面要介紹一種新式的標(biāo)記方法（Lightning-Link®），該方法相比傳統(tǒng)方法有很多優(yōu)勢