本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖钦莆招∈蟛G丸、附睪及輸精管精子采集方法；掌握血球計(jì)數(shù)板法精子計(jì)數(shù)和運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)的方法；通過睪丸、附睪及輸精管精子運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)，認(rèn)識(shí)精子在睪丸產(chǎn)生后，在附睪內(nèi)成熟的過程；掌握精子抹片方法；掌握染色法進(jìn)行精子結(jié)構(gòu)觀察和頂體結(jié)構(gòu)觀察的方法，認(rèn)識(shí)精子的正常結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)方法原理    哺乳動(dòng)物的精子形成后必須經(jīng)過在附睪內(nèi)發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化方面的變化而終達(dá)到成熟后，才能獲得向前運(yùn)動(dòng)的能力，這種向前運(yùn)動(dòng)是精子受精能力的重要指標(biāo)。哺乳動(dòng)物精子包括頭部和尾部二個(gè)主要部分，頸部介于頭部和尾部之間，形成頭部和尾部的連接。精子頭部主要由核組成，頭部前端是頂體，頂體包圍核的前端形成帽狀。精子頸部變細(xì)并形成頭部和尾部的連接。尾部是精子的運(yùn)動(dòng)器官，可以分為中段、主段和末段。
實(shí)驗(yàn)材料    小鼠
試劑、試劑盒    龍膽紫酒精福爾馬林磷酸鹽緩沖液姬姆薩液
儀器、耗材    吸水紙滴瓶滴管載玻片蓋玻片剪刀膠布記號(hào)筆隔水式恒溫培養(yǎng)箱CZB液KSOM液注射器器械盤鑷子手術(shù)剪眼科剪眼科鑷眼科異物針表玻皿試管顯微鏡擦鏡紙恒溫水浴鍋血球計(jì)數(shù)板
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、精子采集

左手捏小鼠尾部，右手持鑷子，或以圖4-1所示方法，以頸部脫臼法處死實(shí)驗(yàn)鼠。使處死的小鼠仰臥，用用75 %酒精棉球消毒腹部開口部位被毛及皮膚。剪開腹壁，暴露生殖系統(tǒng)(圖3-1，4-2A，B)。無(wú)菌采取分離睪丸、附睪及輸精管。在含培養(yǎng)液的表玻皿中，用眼科剪除去睪丸、附睪及輸精管周圍的系膜及脂肪，并沖洗干凈，以免血液或脂肪球混入液體妨礙精子觀察。

將分離并清洗干凈的睪丸、附睪及輸精管，用眼科剪再分離為睪丸、附睪尾及附帶的小段輸精管、其余部分的輸精管三部分，棄去附睪頭。采集睪丸精子時(shí)，將睪丸橫切為若干段或組織塊，在表面皿中，加1 mL培養(yǎng)液，用眼科鑷子輕輕擠壓睪丸組織塊，把精子擠入培養(yǎng)液中，去掉組織塊。于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育20分鐘，使精子自行散開。

采集附睪尾精子時(shí)，將其剪成幾段，用眼科鑷子輕輕擠壓附睪和輸精管，把精子擠入培養(yǎng)液中，去掉附睪和輸精管。于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育20分鐘，使精子自行散開。采集輸精管精子時(shí)，由于小鼠輸精管非常細(xì)，不能直接沖洗管腔，將輸精管放入含有1mL 培養(yǎng)液的表面皿內(nèi)，在實(shí)體顯微鏡下，用一支眼科用異物針固定輸精管，用另一支異物針向相反方向縱向撕開輸精管，精子會(huì)浮游到稀釋液中。將大塊輸精管組織撥開，用吸管連同精子吸出液體部分，裝于2 mL具塞試管中暫存。

二、精子運(yùn)動(dòng)能力檢查

用滴管吸取精液，放于血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室與蓋玻片接觸處，使精液自然流入計(jì)數(shù)室中。計(jì)數(shù)中間5個(gè)中方格(對(duì)角5個(gè)或四角及中間)內(nèi)80個(gè)小方格的精子數(shù)，計(jì)數(shù)值為X。計(jì)算時(shí)，先計(jì)數(shù)死精子的X1值，將計(jì)數(shù)板置于50 ℃水浴鍋中的搪瓷盤中，在50 ℃條件下10 min殺死精子，計(jì)數(shù)總精子數(shù)X2值，(X2-X1)/X2為精子運(yùn)動(dòng)能力。計(jì)數(shù)時(shí)每份精子用三個(gè)計(jì)數(shù)板重復(fù)計(jì)數(shù)三次，取平均值。

三、精子整體結(jié)構(gòu)觀察

取1小滴保存精液在載玻片上，將樣品滴以拉的形式制成抹片。用0.5 %龍膽紫酒精染色3min,自然干燥、水洗后鏡檢。鏡下可觀察到大多數(shù)為結(jié)構(gòu)正常的精子，部分為畸形精子，如頭部畸形(如頭部巨大、瘦小、細(xì)長(zhǎng)、圓形、輪廓不明顯、皺縮、缺損、雙頭等)，頸部畸形(頸部膨大、纖細(xì)、屈折、不全、雙頸等)，尾部中段畸形(膨大、纖細(xì)、彎曲、屈折、不全、雙體等)，尾部主段畸形(彎曲、屈折、回旋、短小、長(zhǎng)大、雙尾等)分類計(jì)數(shù)。有的精子尾部發(fā)育未完成，為未成熟精子，可視為畸形精子。

四、精子頂體結(jié)構(gòu)觀察

精液抹片自然干燥2～20 min，以1～2mL的福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定15 min，水洗后自然干燥。用姬姆薩工作液染色90 min，水洗，風(fēng)干。置于1000倍顯微鏡下用油鏡觀察、計(jì)數(shù)頂體異常精子。鏡下可觀察到大多數(shù)精子頂體結(jié)構(gòu)正常，部分精子頂體異常，精子頂體異常主要表現(xiàn)為腫脹、缺損、部分或*脫落。