狂犬病病毒實(shí)時熒光RT-PCR檢測試劑盒說明書

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用途本試劑盒采用實(shí)時熒光RT-PCR 方法用于動物狂犬病疑似腦組織、唾液樣品中狂犬病病毒
RNA 的檢測。
原理利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取樣品總RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA 為模板，以
引物為起點(diǎn)合成與RNA 模板互補(bǔ)的cDNA 鏈。在熱啟動Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火
及延伸的循環(huán)，使特異DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的DNA 雜交，利
用Taq 聚合酶的5'→3'外切活性，使熒光探針的報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號，利
用熒光PCR 儀檢測特異性熒光信號，根據(jù)樣品Ct 值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果。
狂犬病病毒實(shí)時熒光RT-PCR檢測試劑盒說明書試劑盒組成
名稱50 頭份貯藏條件
裂解液30 mL
室溫（A 盒）
洗液60 mL
洗脫液10 mL
吸附柱和收集管50 套
陰性對照1 mL
-20 ℃（B 盒）
陽性對照600 μL
無菌無核酸酶水600 μL
RT-PCR 反應(yīng)液600 μL
酶混合液24 μL
熒光探針115 μL
保存期本產(chǎn)品有效期為12 個月。
需要自備的器材
1．儀器：分析天平、離心機(jī)、熒光PCR 擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 μL、20
μL、200 μL、1000 μL）。
2．耗材：熒光PCR 反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水
處理的滅菌離心管、吸頭（10 μL、200 μL、1000 μL）、滅菌雙蒸水。
狂犬病病毒實(shí)時熒光RT-PCR檢測試劑盒說明書使用注意事項(xiàng)
1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實(shí)驗(yàn)室。
2．PCR 整個試驗(yàn)分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)。嚴(yán)
禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000 rpm 離心15 s，
使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立
即放回-20 ℃。
4．在RNA 提取過程中，避免RNA 酶污染，盡量縮短操作時間。
5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
6．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得好的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須。
7．反應(yīng)體系應(yīng)在特定配液區(qū)或者超凈工作臺中配制，整個實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格控制污染。
8．反復(fù)凍融試劑將減低檢測靈敏度，本試劑盒應(yīng)在3 次內(nèi)用完，請嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：對大動物（如犬、貓、牛等）的腦組織標(biāo)本的采集使用快速采樣法，即：用塑料管從
頭部枕骨大孔或能看見腦組織的位置向眼眶處斜插（或用粗穿刺針從眼角眶向頭部枕骨大孔處斜
插），然后阻斷塑料管尾部與外界大氣壓強(qiáng)連通，迅速將塑料管拔出。盡量使塑料管通過犬腦的大腦、
中腦和小腦部位。取出的塑料管中應(yīng)有腦組織；將腦組織標(biāo)本放入無菌離心管中，記錄編號后保存
備用。
2 樣品保存：所有狂犬病標(biāo)本在2～8℃保存應(yīng)不超過24 小時；在-20℃冰箱冷凍保存應(yīng)不超過6 個
月；長期保存時，以-70℃或-80℃冰箱為易。冰凍保存要避免反復(fù)凍融，多凍融3 次。
3 樣品處理：每份樣品分別處理。
3.1 組織樣品處理：分別從待檢腦組織腦干、小腦及海馬回三個不同的部位各稱取樣品約1g，用手
術(shù)剪剪碎混勻，再取0.05g 于研磨器中研磨，加入1mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，取100μL 勻漿液于1.5mL
滅菌離心管中。
3.2 陽性對照處理：取陽性對照100μL，置1.5mL 滅菌離心管中。
3.3 陰性對照處理：取陰性對照100μL，置1.5mL 滅菌離心管中。
操作步驟
1 病毒RNA 的提取
1.1 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液600 μL，充分顛倒混勻，室溫靜置3～
5 min。
1.2 將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時
堵塞吸附柱），13000 rpm 離心30 s。
1.3 棄去收集管中液體，加入600 μL 洗液，13000 rpm 離心30 s。
1.4 重復(fù)步驟1.3。
1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心2 min，以除去殘留的洗滌液。
1.6 將吸附柱移入新的1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液50 μL，室溫靜置1 min，13000 rpm
離心30 s，離心管中液體即為模板RNA。
2 實(shí)時熒光RT-PCR 操作
設(shè)被檢樣品、陰性對照和陽性對照總和為N，則反應(yīng)體系配制如下：
試劑體系
無菌無核酸酶水5.2（N+1）μL
RT-PCR 反應(yīng)液10（N+1）μL
酶混合液0.4（N+1）μL
熒光探針1.4（N+1）μL
將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝每個反應(yīng)管中各17 μL。
分別取3 μL 模板RNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻并作好標(biāo)記，在熒光PCR 儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：
45 ℃ 15 min，95 ℃ 1min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每個循環(huán)第二步（60℃ 35s）收集熒光信號，共
40 個循環(huán)。（報告基團(tuán)“FAM”，淬滅基團(tuán)“None”）。
結(jié)果判定
1 結(jié)果分析條件設(shè)定閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過陰性對照擴(kuò)增曲線的高點(diǎn)。不同儀器
可根據(jù)儀器噪音
情況進(jìn)行調(diào)整。
2 結(jié)果描述及判定
陽性對照Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對照無Ct 值并且無特定擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成
立；被檢樣品Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為狂犬病病毒陽性；被檢樣品30＜Ct＜37 并出現(xiàn)特定
的擴(kuò)增曲線，需重新取樣提取RNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判定為陽性；被檢樣品
Ct 值≥37 時，超過本方法檢測靈敏度范圍，判定為陰性；對于某些未呈現(xiàn)S 型曲線，但本底較高的
樣品，應(yīng)為陰性。

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