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技術(shù)文章

免疫細(xì)胞化學(xué)與圖像分析

閱讀:889          發(fā)布時(shí)間:2018-9-12

在細(xì)胞生物學(xué)中,一個(gè)常見的問題是如何獲取與細(xì)胞功能相關(guān)的各種定量測(cè)量信息。在免疫細(xì)胞化學(xué)中也存在同樣的問題。制作免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本環(huán)節(jié) 較多,只要有一個(gè)環(huán)節(jié) 失誤就會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,除了需要精制的藥品外,還需要熟練的技術(shù)。那么,做成了理想的標(biāo)本后,如何進(jìn)行觀察,才能獲得盡量多的的各種定量信息,而且使這些信息能較客觀的反映出來,這就是本章 的編寫目的。

一、定量分析的重要性

目前有許多研究免疫細(xì)胞化學(xué)的文章 ,是做定性和定位研究的。如有文獻(xiàn)中提到,P物質(zhì)在腦組織中存在于30處以上,這只是解決了定性定位問題,這些部位含P物質(zhì)的量是否相同?可否用快速簡(jiǎn)便的方法對(duì)細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)產(chǎn)物的量進(jìn)行分析?從而可進(jìn)行比較。所謂反應(yīng)產(chǎn)物的“量”包括顏色深淺,其所占的長(zhǎng)度或面積等,就要借助于圖像分析儀(image analyzer)了。

以往我們對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)或一般組織化學(xué)光鏡標(biāo)本的觀察,對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的量常用“+”號(hào)表示,一般可分為0~+++,共五個(gè)等級(jí),這種方法對(duì)差別較大的標(biāo)本當(dāng)然還是可以用的,但存在以下三方面的問題:①同一張標(biāo)本,不同的觀察者可以得到出不同的結(jié)論,因?yàn)檫@種分級(jí)沒有明確的客觀標(biāo)準(zhǔn);②即使同一張標(biāo)本同一個(gè)觀察者,間隔若干天后進(jìn)行再次觀察時(shí),可能結(jié)論也不一樣的;③后一點(diǎn)也是重要的一點(diǎn),人的視覺是有一定限制的,用一般觀察法實(shí)際上已經(jīng)丟失掉了許多可貴的信息,因?yàn)槟悴煊X不到實(shí)際上存在的較小的差異。因此我們力求有一個(gè)客觀的比較精密的標(biāo)準(zhǔn)。除了常用的儀器如顯微分光光度計(jì)(microspectrophotometer)和顯微密度計(jì)(microdensitometer)等以外,還可用圖像分析儀進(jìn)行測(cè)量。前二者已有許多有關(guān)著作中介紹過,就其與靈敏來說都是夠的,但卻不能同時(shí)測(cè)出標(biāo)本中某些成分的面積、體積或長(zhǎng)度等其他極有用的參數(shù)。圖像分析儀的分析廣度則要大得多,并能明顯地提高工作效率,所得到的各種數(shù)據(jù)可通過分析儀上的計(jì)算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,只要將各種統(tǒng)計(jì)學(xué)公式輸入計(jì)算機(jī),選擇其中你所采用的公式,即可快速得出分析結(jié)果,告訴你有無顯著性差異。

二、圖像分析儀簡(jiǎn)介

圖像分析儀又稱圖像分析系統(tǒng)(image analysis system),主要用來解決如何客觀地較地用數(shù)字來表達(dá)存在于標(biāo)本中的各種信息,可稱為數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)。它已經(jīng)成為一種*的科學(xué)研究工具,并且逐漸展現(xiàn)出巨大的潛能。圖像中包含著極其豐富的內(nèi)容,是人們從客觀世界中獲得信息的重要手段,因此,正確地測(cè)量和處理圖像已成為測(cè)量技術(shù)中的重要課題,并廣泛應(yīng)用于航空遙感測(cè)量、金屬圖像測(cè)量、微電子技術(shù)中微圖形檢測(cè)、精密機(jī)件尺寸檢測(cè),光波干涉圖、醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究及應(yīng)用等有關(guān)領(lǐng)域中。圖像測(cè)量將會(huì)隨著信息科學(xué)和人工智能的發(fā)展而日益顯示其重要作用?,F(xiàn)代圖像測(cè)量是光學(xué)、電子學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等相互滲透的跨學(xué)科的結(jié)果,涉及廣泛的學(xué)科領(lǐng)域,醫(yī)學(xué)只是其中一個(gè)分支。

我們?cè)诠鈱W(xué)顯微鏡下看到的是光學(xué)圖像,而在圖像分析儀屏幕上看到的是電子圖像,因此在顯微圖像分析中,整個(gè)系統(tǒng)重要關(guān)鍵的工作就是要保證得到的電子圖像能地反映出光學(xué)圖像,這個(gè)過程由攝像機(jī)(圖像掃描器)、顯像管和圖像處理機(jī)(計(jì)算機(jī))來完成(圖9-1)。圖像可通過光學(xué)顯微鏡、透射電鏡或掃描電鏡傳到攝像機(jī)而產(chǎn)生電信號(hào),照片或膠卷上的圖像也可以通過攝像機(jī)反映到電視屏幕上進(jìn)行分析。圖像在電視屏幕上是由許多像素(pixel)構(gòu)成的,單位面積屏幕上像素愈多則圖像愈清晰,即分辨率愈高。各廠家生產(chǎn)各種不同規(guī)格的產(chǎn)品,如有640×480像素的、896×704像素的、512×480像素的屏幕等。當(dāng)圖像顯示時(shí),每個(gè)像素含有兩方面的信息,即此像素的灰度及其在標(biāo)本中的位置,兩種信息決定了圖像的形狀和顏色深淺。

 

圖9-1 圖像分析系統(tǒng)簡(jiǎn)圖

有關(guān)圖像分析的學(xué)術(shù)活動(dòng),1963年召開了屆討論會(huì),此后每四年有一次學(xué)術(shù)交流活動(dòng)。1983年在美國(guó)召開了第六屆學(xué)術(shù)會(huì)議,與會(huì)代表約150人。1987年9月在法國(guó)召開了第七屆學(xué)術(shù)會(huì)議,在200多正式代表中有2/3是生物醫(yī)學(xué)方面的專家,而我國(guó)生物醫(yī)學(xué)界沒有人被邀參加,可見我國(guó)過去對(duì)如何將圖像分析應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)方面的研究重視得不夠,對(duì)上這方面的信息掌握得不及時(shí)。國(guó)內(nèi)自70年代末期相繼從國(guó)外引進(jìn)大型自動(dòng)圖像分析儀后,80年代才開始將醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究與圖像分析方法結(jié)合起來。從1981~1983年召開了三次全國(guó)體視學(xué)與圖像圖像分析學(xué)術(shù)會(huì)議,1987年召開了第四次學(xué)術(shù)會(huì)議,雖然在宣讀的論文中醫(yī)學(xué)研究已占了很大的比例,但具體應(yīng)用到免疫細(xì)胞化學(xué)則實(shí)例極少,僅是一個(gè)開端。1988年中國(guó)體視學(xué)會(huì)正式成立,是在民政部登記的屬于新學(xué)科的個(gè)學(xué)會(huì)。并于1991年11月在重慶第三軍大學(xué)召開了“全國(guó)計(jì)量學(xué)在形態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用研討會(huì)”,與會(huì)代表來自22個(gè)省市,形態(tài)計(jì)量學(xué)的方法已應(yīng)用到組織學(xué)、解剖學(xué)、病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域。更為可喜的是過去此類研討會(huì)都是請(qǐng)外商到會(huì)介紹他們的產(chǎn)品,為他們提供中國(guó)市場(chǎng),而此次會(huì)議上本國(guó)的三家研制生產(chǎn)圖像分析儀的單位在大會(huì)上介紹各自的產(chǎn)品,以較好的性能價(jià)格比與國(guó)外產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng),擴(kuò)大國(guó)內(nèi)市場(chǎng),我國(guó)在此領(lǐng)域的研究進(jìn)展也是很快的。

三、常用的測(cè)量方法

(一)灰度

灰度(grey level)指圖像各種分顏色的深淺程度。比較的圖像分析儀可將灰度分成為256級(jí),也有的只能將灰度分成64級(jí),總之都是2n,24是26256是28。免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本上反應(yīng)產(chǎn)物的染色深淺即可用灰度來表示。能將一張標(biāo)本上不同染色深度區(qū)分為幾十或更多的等級(jí),這是人眼所不及的。因此,某些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,如果用光學(xué)顯微鏡作一般的觀察,似乎實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無明顯差異,而用圖像灰度法經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,則可反映出顯著性差異,說明僅僅用顯微鏡觀察是不夠的,在某些情況下可能會(huì)辜負(fù)了制片過程中所花費(fèi)的大量精力,而得不到應(yīng)有的結(jié)果。

由于免疫反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)不一定是均勻分布的,在同一個(gè)細(xì)胞中就可產(chǎn)生各種灰度,這種情況如何進(jìn)行比較?有兩類方法可供選用:一種是測(cè)每個(gè)細(xì)胞的平均灰度,近年較新型的圖像分析系統(tǒng)有此性能,而比較早期的或比較簡(jiǎn)單的圖像分析系統(tǒng)就沒有這種性能,例如某一細(xì)胞在電視屏幕上占有120個(gè)像素,按灰度級(jí)進(jìn)行測(cè)量后,也許120個(gè)像素中有十多種不同的灰度,分析儀可立即顯示其平均灰度。另一種方法是在反應(yīng)產(chǎn)物不均勻的細(xì)胞中可用每一種灰度所占的百分率來表示,例如你要觀察1000個(gè)細(xì)胞,在這些細(xì)胞中各種灰度所占的百分率可測(cè)出,并作出曲線,或用其他統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理,來進(jìn)行比較。

如果用彩色圖像分析儀,除了上述的灰度測(cè)量以外,還可以將不同的灰度編成不同的顏色,使圖像更鮮明美麗,而且便于測(cè)量。彩色有兩種情況:在屏幕上出現(xiàn)與標(biāo)本一樣的顏色稱為真色(real color),如果將不同的灰度轉(zhuǎn)換成不同的顏色則稱為假色(pseudo color),應(yīng)用假色的目的是增強(qiáng)對(duì)比度,來改善對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的視覺識(shí)別,同時(shí)可增強(qiáng)輪廓用來強(qiáng)調(diào)結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié) 。例如,免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的非標(biāo)記抗體過氧化物酶—抗過氧化物酶法,終反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色,假設(shè)在腦內(nèi)某核團(tuán)的許多細(xì)胞中,呈現(xiàn)出不同深度的棕色,深淺差別較大者顯示在屏幕上人眼還能區(qū)別,若差別小的則不易區(qū)別了,操作者可將灰度11~15用紅色顯示,灰度16~20用藍(lán)色顯示、灰度21~25用黃色顯示、灰度26~30用綠色顯示等。一般可呈現(xiàn)數(shù)十種顏色。也可以將灰度11~20用深紅色顯示、灰度21~30用淡紅色顯示、灰度31~40用藍(lán)色顯示等,由操作者隨心所欲加以編輯。這種圖像如拍攝下來,旁邊顯示出一條彩色帶,表明什么顏色代表什么范圍的灰度,如此可將一種顏色的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本轉(zhuǎn)換成多種彩色的,對(duì)比鮮明的照片。

有些圖像分析儀中帶有光密度計(jì)組件,光密度計(jì)能將掃描器視頻信號(hào)變換成對(duì)數(shù)等值,然后數(shù)值化,就能用光密度單位來校正。因此,光密度計(jì)把被測(cè)物的積分光密度作為主要輸出,所謂積分光密度即各個(gè)單獨(dú)探測(cè)的像素密度分布的總和。因?yàn)槿菀椎玫奖粶y(cè)物的面積,也就很容易求出平均密度。光密度在細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的定量領(lǐng)域內(nèi)極為有用。灰度是一種相對(duì)值,因?yàn)槟憧蓪?biāo)本上的灰度隨你編輯分為64級(jí)、也可將其分為128級(jí)或者256組,而光密度是值。在文獻(xiàn)中光密度常用OD表示(optical density)。有的單位購(gòu)置了圖像分析儀后才發(fā)現(xiàn)不能作光密度測(cè)量,但已無法再去掉換,所以在購(gòu)買前必須詳細(xì)了解其性能,包括屏幕像素?cái)?shù)、有無光密度計(jì)組件等。

(二)長(zhǎng)度

形狀不規(guī)則的線形組織結(jié)構(gòu),一般方法很難計(jì)算出其長(zhǎng)度,如組織中的毛細(xì)血管,神經(jīng)纖維、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中的各種膜性結(jié)構(gòu)等,以往常用排列稀疏或密度集等詞描述,圖像分析儀則可測(cè)出各種圖像周界線的長(zhǎng)度。例如:在活檢組織的子宮頸上皮細(xì)胞的電子顯微鏡照片上,測(cè)出在一定范圍的細(xì)胞膜長(zhǎng)度為8128像素,橋粒長(zhǎng)度為1229像素,計(jì)算出橋粒長(zhǎng)度占細(xì)胞膜總長(zhǎng)度的15%,wiernik等用此方法觀察到癌細(xì)胞的橋粒值遠(yuǎn)小于正常細(xì)胞,提出這可能與癌細(xì)胞易于失去相互間的的細(xì)胞連接,從而形成轉(zhuǎn)移有關(guān)。用免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示的神經(jīng)纖維,在局部組織中可能出現(xiàn)縱橫交錯(cuò)的復(fù)雜圖像,用圖像分析儀可獲得單位面積內(nèi)神經(jīng)纖維的總長(zhǎng)度。又如去甲腎上腺素神經(jīng)纖維呈串珠樣,如果測(cè)出一定范圍內(nèi)神經(jīng)纖維總長(zhǎng)度及局部膨大數(shù)目,即可計(jì)算出串珠平均間隔距離,比較。

(三)面積

無論是在光鏡或電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本的觀察中,都要涉及有關(guān)標(biāo)本中某些結(jié)構(gòu)的面積問題。即使是極不規(guī)整的結(jié)構(gòu),用圖像分析法容易算出其面積。在一定的放大倍數(shù)下,每μm2中含多少像素可以測(cè)出,畫出待測(cè)結(jié)構(gòu)的輪廓,在所勾畫的范圍內(nèi)含多少像素是立即可顯示出來的,這樣,很快可算出面積的數(shù)值。例如免疫電鏡技術(shù)中的鐵蛋白法、膠體金法等,可用上述方法進(jìn)行單位面積中反應(yīng)產(chǎn)物顆粒的計(jì)數(shù),可進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)條件的比較。

曾有人在肝臟切片上進(jìn)行圖像分析,在一定范圍內(nèi)所有細(xì)胞核的總面積顯示為51554像素,其中肝細(xì)胞核總面積為27431像素,可知肝細(xì)胞核占全部細(xì)胞核總面積的53%。

四、圖像分析儀工作程序

使用者對(duì)硬件不需操縱,它們可完成復(fù)雜的運(yùn)行過程,完整的計(jì)算機(jī)軟件可按實(shí)際需要使其執(zhí)行功能。對(duì)操作者來說,圖像分析儀的實(shí)際操作很少,幾乎*是通過一個(gè)稱為光電鼠標(biāo)(mouse)的附件來操縱的。計(jì)算機(jī)屏幕上顯示出多項(xiàng)指令,可由光電鼠標(biāo)來指明你所需要的程序,光電鼠標(biāo)可控制計(jì)算機(jī)屏幕上的一個(gè)光標(biāo),移動(dòng)光電鼠標(biāo)也隨著移動(dòng),將光標(biāo)移到計(jì)算機(jī)屏幕上顯示的某項(xiàng)功能的區(qū)域內(nèi),就表示選擇了該項(xiàng)功能,可以開始工作,極簡(jiǎn)便。圖9-1為圖像分析儀的簡(jiǎn)化圖。

圖像分析儀主要包括輸入(input)、中央信息處理機(jī)(central processor)和輸出(output)三大部分。實(shí)際上,工作程序并不是一成不變的,后面的步驟的信息常會(huì)反饋到前面,于是又重復(fù)前面的程序,具體步驟如下:

1.標(biāo)本成像 移動(dòng)標(biāo)本使需要觀察的部位在電視攝像機(jī)上得到適當(dāng)放大的圖像,標(biāo)本包括組織切片或電鏡照片或照相底片等。

2.圖像獲取 用電視攝像機(jī)或其他方法將圖像轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào),在此過程中,攝像機(jī)的性能極重要,不能使用那些便宜的適用于監(jiān)視的電視攝像機(jī),一定要用使圖像具有很好的清晰度的攝像機(jī)。

3.加強(qiáng)圖像 加強(qiáng)電子圖像(electronic image)使其更適合于分析。

4.檢測(cè)檢測(cè)(detection )是圖像分析過程中設(shè)法從圖像中確定并且分離出需要分析灰度相的步驟,“相(phase)”是圖像中我們想要測(cè)量的部分的總稱。檢測(cè)是通過選擇一定的閾值來完成的,如果所需相比背景暗,那么所有暗于下限的東西都被選,例如相的灰度是20~50,20是下限,50是上限,背景的灰度小于20,檢定時(shí)暗于灰度20的東西都被選。如果所需相比背景亮,如免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本,那么亮于上限的東西都被選。如果所需相比背景亮,如免疫熒光化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本,那么亮于上限的東西都被選,例如相的灰度是5~20,5是下限,20是上限,背景灰度大于20,所謂上限既指比灰度20淺的亦即灰度20以下的相被選,而背景是暗于上限的,不被選作測(cè)量。如果相暗于圖像某些部分而又亮于圖像的另一些部分,那就要在二限之間的部分選擇灰度了。

在檢測(cè)過程中要使用圖像框(image frame)和測(cè)量框(measurement frame)。檢測(cè)只在圖像框內(nèi)進(jìn)行,框的大小按需要而定,測(cè)量框在圖像之內(nèi),是進(jìn)行測(cè)量的部位。兩個(gè)框之間的部分稱為保險(xiǎn)區(qū)(圖9-2)。

圖像中每個(gè)被測(cè)物都有其*的特征計(jì)算點(diǎn)(feature count point, FCP),FCP在被測(cè)物的點(diǎn),如圖9-2中上面10個(gè)被測(cè)物的FCP均在測(cè)量框內(nèi),可計(jì)數(shù)或作其他測(cè)量,而下面2個(gè)被測(cè)物的FCP不在測(cè)量框內(nèi),則不計(jì)在內(nèi),在測(cè)其他區(qū)域時(shí)再計(jì)算,有的被測(cè)可能被測(cè)量框截?cái)?,那么測(cè)量框外的那部分被測(cè)物應(yīng)該位于保險(xiǎn)區(qū),即保險(xiǎn)區(qū)要大于被測(cè)物,才能觀察FCP是否在測(cè)量框內(nèi)而決定取舍。這樣當(dāng)換到相鄰的區(qū)域進(jìn)行測(cè)量時(shí),不會(huì)使某圖形重復(fù)測(cè)量,可避免測(cè)量誤差,圖9-3顯示放置標(biāo)本的顯微鏡載物臺(tái)的移動(dòng)方式,可由計(jì)算機(jī)控制,用編制好的程序,使載物臺(tái)按一定方式移動(dòng),也可以人工操作。圖中可以看出每個(gè)部位都將通過測(cè)量框,不會(huì)遺漏。

 

圖9-2 示測(cè)量框位置,圖中有10個(gè)被測(cè)物的FCP在測(cè)量框內(nèi)

5.陰影校正校正圖像細(xì)節(jié) 直到正確無誤并達(dá)到能被測(cè)量的要求。所謂陰影(shading)是指人眼看來是均勻的視場(chǎng)內(nèi)存在著不均勻的電子反應(yīng),這使得灰度相同的圖像成分由于在視場(chǎng)中所處位置不同而顯示出不同的灰度,這種影響必須校正才能使圖像得到準(zhǔn)確測(cè)量。陰影有三個(gè)主要的來源:

(1)圖像源的不均勻的光照。

(2)穿過透鏡時(shí)光路發(fā)生變化引起的透鏡陰影。

(3)顯像管本身的圖像靈敏度差異引起的掃描陰影。]

任何圖像分析在具體運(yùn)用中都有這些陰影存在,前二者可通過精密安裝圖像分析儀來控制,后者可通過對(duì)顯像管的質(zhì)量嚴(yán)格篩選來減少影響。陰影可貯存起來,并且在每上次掃描時(shí)同步地從圖像信號(hào)中去掉。

 

圖9-3 顯微鏡載物臺(tái)移動(dòng)方式1.載物臺(tái)移動(dòng)方向;

2.暈微鏡觀察視場(chǎng);3.圖像框;4.測(cè)量框

6.測(cè)量經(jīng)以上各步驟后,可以用圖像分析儀的計(jì)算機(jī)對(duì)圖像進(jìn)行測(cè)量來取得所需的參數(shù),如灰度、面積、長(zhǎng)度、個(gè)數(shù)等。原始的參數(shù)可由計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)化成容易理解的數(shù)值,例如面積可由某圖形所占像素?cái)?shù)轉(zhuǎn)化為平方微米,使觀察者容易理解。

7.資料分析 將資料進(jìn)行分類,并加以說明,以便做出結(jié)論。也可將資料貯存,隨意可提取出來,供研究者使用。

8.其他事項(xiàng)

(1)標(biāo)本要清潔:如果標(biāo)本上有污點(diǎn),研究者可分辨哪些是正常的免疫反應(yīng)產(chǎn)物,哪些是污染引起的,但儀器不會(huì)區(qū)別,只要是電視屏幕上測(cè)量框內(nèi)有的東西都會(huì)被測(cè)量,如測(cè)灰度時(shí)切片上有污點(diǎn),會(huì)影響結(jié)果。

(2)電壓要穩(wěn)定:這一點(diǎn)是結(jié)合我國(guó)目前情況而言,雖然儀器使用時(shí)是通過穩(wěn)壓器的,也要經(jīng)常注意穩(wěn)壓器上的電壓指針是否穩(wěn)定,否則也影響結(jié)果。

(3)價(jià)格問題:圖像分析儀廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,因此并不是價(jià)格愈貴就愈好,而要看我們的應(yīng)用目的及其性能,以免購(gòu)置一些用不著的昂貴的附件而造成浪費(fèi)。一般可以從以下三方面來考察儀器性能:在本專業(yè)范圍內(nèi)應(yīng)用的廣度、運(yùn)算的速度和操作的方便程度。

(4)合作使用:分析儀價(jià)格昂貴,根據(jù)國(guó)內(nèi)目前實(shí)際情況,有些工廠購(gòu)置了圖像儀而僅僅用作工業(yè)金相分析,閑置的時(shí)間很多,我們從事醫(yī)學(xué)研究的人可以去充分利用它的性能,聯(lián)合進(jìn)行科研工作,發(fā)四川省目前級(jí)的圖像分析儀就是在工廠中而不是在高等學(xué)校中。

五、沒有圖像分析儀可否進(jìn)行圖像分析?

當(dāng)沒有圖像分析儀時(shí),研究者早已想到用網(wǎng)格來進(jìn)行圖像分析,也獲得了客觀的評(píng)定結(jié)果。網(wǎng)格可分為兩大類:一類是置于目鏡內(nèi)的網(wǎng)格,可測(cè)量切片標(biāo)本上的各種數(shù)據(jù);另一類是大的網(wǎng)格,可放在照片上,光鏡電鏡照片均可用,對(duì)照片上的各種結(jié)構(gòu)可進(jìn)行測(cè)量。以上二者至今仍被采用。英國(guó)標(biāo)線片公司提供許多型號(hào)的市售標(biāo)線片(即網(wǎng)格)。有的國(guó)家制造的顯微鏡,將目鏡與帶有六種不同型號(hào)標(biāo)線片的旋轉(zhuǎn)盤裝在一起,以便于觀察者作各種測(cè)量。國(guó)內(nèi)某些單位有自制標(biāo)線片,并有少量出售。

Aalto等1982年曾在“免疫組織化學(xué)的形態(tài)測(cè)量法一卵巢腫瘤內(nèi)的胚性癌抗原”一文中推薦用視野評(píng)分法,他用三種方法對(duì)PAP法免疫組化標(biāo)本進(jìn)行分析:①對(duì)全切片的染色進(jìn)行分級(jí)。②在10×10放大倍數(shù)下,每一切片用目鏡網(wǎng)格任選25個(gè)方形視場(chǎng)進(jìn)行觀察,并對(duì)每一視場(chǎng)進(jìn)行分級(jí)。③在25個(gè)視場(chǎng)內(nèi)取25個(gè)點(diǎn)的著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)。染色強(qiáng)度分為0級(jí)、1級(jí)(輕度)2級(jí)、(中度)、3級(jí)(重度)。方法①的結(jié)果不同于②③,而方法②和③差別不大,說明主觀估算的鑒別能力低,一般鏡下觀察不能確切反映染色強(qiáng)度。

用網(wǎng)格進(jìn)行圖像分析的方法很多,如用免疫熒光等方法顯示神經(jīng)纖維,要表示各處的纖維密度不同,除了文字描述如致密、稀疏等以外,用網(wǎng)格法就要客觀一些,在目鏡或照片上放上網(wǎng)格,觀察陽性神經(jīng)纖維與網(wǎng)格上的線條的交叉次數(shù),排列密集的區(qū)域交叉次數(shù)必然多些,這就比較客觀,重復(fù)性也較好。

用熒光顯微鏡觀察免疫熒光標(biāo)本,Ploem曾在1977年指出熒光強(qiáng)度之差至少要二倍才能在直觀估計(jì)時(shí)顯示出差別,說明人視覺對(duì)熒光強(qiáng)度變化不夠敏感。作者在工作中體會(huì)到,可利用照相的自動(dòng)曝光系統(tǒng)來作相對(duì)定量,因?yàn)闊晒庥鷱?qiáng)則自動(dòng)曝光時(shí)間愈短,熒光弱則自動(dòng)曝光時(shí)間長(zhǎng),相當(dāng)敏感,用眼睛觀察二個(gè)熒光強(qiáng)度幾乎無差別的細(xì)胞,也能在自動(dòng)曝光時(shí)間上顯示出差別來。作者曾經(jīng)將許多熒光標(biāo)本用相同的曝光時(shí)間拍在同一個(gè)膠卷中,沖洗后,熒光強(qiáng)的區(qū)域膠卷上顯色深,熒光弱的區(qū)域膠卷上顯色淺,因?yàn)闊晒馊菀状銣纾么朔蓪⒛z卷較長(zhǎng)期保存,而且膠卷上的信息還可通過圖像分析儀測(cè)灰度等數(shù)據(jù)。這些都是在實(shí)踐中的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn),供讀者參考。

用網(wǎng)格測(cè)量的具體操作舉例:圖9-4為一關(guān)聯(lián)方測(cè)格,由于測(cè)點(diǎn)、測(cè)線、測(cè)面之間有互相關(guān)聯(lián)的關(guān)系,故稱為關(guān)聯(lián)方測(cè)格。方格直線交叉稱為測(cè)點(diǎn),總數(shù)為100個(gè),方格中所有直線稱為測(cè)線,小方格邊長(zhǎng)為d如圖中所示,測(cè)線總長(zhǎng)度為200d,整個(gè)大方格為測(cè)面,測(cè)面總面積為100d2,測(cè)格周圍的虛線不是測(cè)線。關(guān)聯(lián)測(cè)格的優(yōu)點(diǎn)是:只在計(jì)數(shù)位于欲測(cè)圖像中的測(cè)點(diǎn)數(shù)P,就可計(jì)算位于該圖像中的測(cè)線長(zhǎng)度L及測(cè)面的面積A。計(jì)算方法為:L=2d·P,A=d2·P。

可將圖9-4攝制于小的透明膠片上,剪成你所用的目鏡筒的內(nèi)徑大小,將其置于目鏡內(nèi),使測(cè)格清晰地疊映組織標(biāo)本的圖像上,則可進(jìn)行測(cè)量。d的長(zhǎng)度可用臺(tái)微尺來確定。也可將9-4復(fù)印在較大的透明膠片上,可用來測(cè)量電鏡照片或光鏡照片,將透明膠片疊加在照片上即可進(jìn)行測(cè)量。圖9-5為一測(cè)量的例子:

 

圖9-4 關(guān)聯(lián)方測(cè)格

 

圖9-5 示測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)

此關(guān)聯(lián)方測(cè)格共有測(cè)點(diǎn)100個(gè)(如果只計(jì)數(shù)粗測(cè)點(diǎn)則有25個(gè)),圖像為一個(gè)腎小體的輪廓,包括血管球和腎小囊腔,測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)的結(jié)果,在腎小囊腔內(nèi)的測(cè)點(diǎn)數(shù)為12,在血管球內(nèi)的測(cè)點(diǎn)為49個(gè),整個(gè)腎小體內(nèi)的測(cè)點(diǎn)為12+49=61個(gè),用臺(tái)微尺測(cè)出d的長(zhǎng)度,則可得到此圖像中腎小囊腔的面積,血管球的面積,腎小體的面積。明小囊腔與腎小體的面積比12:61=19.7%等多個(gè)參數(shù)。

值得提出的是,在顯微鏡下網(wǎng)格的線條有一定寬度,如圖9-6所示。計(jì)數(shù)測(cè)點(diǎn)時(shí)如①箭頭所示,即橫線上緣與豎線右緣交點(diǎn)處為真正的測(cè)點(diǎn),若此點(diǎn)落在圖像外面則不能計(jì)數(shù)。如②箭頭所示,此測(cè)線的上緣才能作為真正的測(cè)線。

 

圖9-6 示真正的測(cè)點(diǎn)與測(cè)線

表面積密度的測(cè)定:免疫細(xì)胞化學(xué)電鏡照片中的膜性結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞膜等都可測(cè)定表面積密度,光鏡標(biāo)本中的各種結(jié)構(gòu)也可同樣測(cè)定。表面積密度是指單位體積參照空間內(nèi)特征物的表面積,通過數(shù)學(xué)運(yùn)算可簡(jiǎn)便地用以下方法測(cè)定:測(cè)量單位面積參照面內(nèi)特征物斷面周界線的長(zhǎng)度。如果某一個(gè)細(xì)胞的電鏡照片作為參照面,線粒體作為特征物,欲測(cè)單位面積電鏡照片內(nèi)線粒體斷面周界線的長(zhǎng)度,可用以下公式:

SV=2IL

SV表面積密度2IL交點(diǎn)密度

IL=測(cè)線與特征物斷面周界線之間的交叉點(diǎn)數(shù)除以參照面內(nèi)測(cè)線總長(zhǎng)度。

圖9-7為一咱擺線測(cè)格,可用來方便地測(cè)表面積密度。圖中的平行直線不是測(cè)線,僅是為了便于計(jì)數(shù)交叉點(diǎn)和測(cè)點(diǎn)而畫上的。圖中的曲線即擺線,也就是測(cè)線,共45條,每條擺線長(zhǎng)度d=1/10測(cè)格寬度(1cycloid arc =1/10×frame width) ,測(cè)格的寬度容易測(cè)量,如用目鏡測(cè)格,可用臺(tái)微尺測(cè)量,如用大的透明膠片,可實(shí)際用尺測(cè)量,因此每條擺線長(zhǎng)度很易算出。測(cè)格中共有45條擺線,其總長(zhǎng)為45d。圖中直角短線(L)示測(cè)點(diǎn),共90個(gè),測(cè)線長(zhǎng)度L與測(cè)點(diǎn)數(shù)P的關(guān)聯(lián)關(guān)系為L(zhǎng)=d/2·P。具體來說,用圖9-7擺線測(cè)格,置于一個(gè)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)照片上,如果整個(gè)測(cè)格均位于照片內(nèi),則參照面內(nèi)測(cè)線總長(zhǎng)度為45d,如果90個(gè)測(cè)點(diǎn)只有60個(gè)落至細(xì)胞內(nèi)(即測(cè)格中有30個(gè)測(cè)點(diǎn)落在此照片外)則參照面內(nèi)的測(cè)線總長(zhǎng)度為d/2·P=d/2×60=30d。擺線與特征物(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體的膜等)的交叉點(diǎn)容易數(shù),用上述IL和SV公式即可得出所需參數(shù)。此公式為經(jīng)過數(shù)學(xué)上的研究而得出,我們可應(yīng)用公式來作表面積密度的研究。

讀者需注意的是:若特征物是各向同性分布,可采用任意方向的隨機(jī)切片。若特征物呈各向異性分布,可采用垂直切片或其他一些方法制作的切片。Mattfeldt等曾提出在一個(gè)組織塊中作三個(gè)互相垂直的切片(three mutually perpendiculer sections )用作研究。目前通用的垂直切片的概念是1986年Baddeley等人提出,指垂直于某任意確定的水平面的隨機(jī)切片,或平行于某一任意確定的垂直軸的隨機(jī)切片。如圖9-8所示,HP為水平面(horizontal plane),VP為垂直面(vertical planes),二個(gè)垂直面互相不是平行關(guān)系,成一定角度。在生物組織中,如皮膚的表皮、各種上皮的外表面均可作為水平面,只要與水平面垂直的各個(gè)方向所切的切片均為垂直切片。骨骼肌纖維的長(zhǎng)軸、長(zhǎng)骨的長(zhǎng)軸均可作為垂直軸,與其平行的切片也作為垂直切片。管狀的器官如消化管、呼吸管道等,可縱向剖開,展平,當(dāng)作水平面,在其中作垂直切片如圖9-9所示:以水平面為基準(zhǔn),垂直切片必需在隨機(jī)的位置和隨機(jī)的方向,在標(biāo)本計(jì)劃中,步是需要隨機(jī),常用一組系統(tǒng)隨機(jī)位置的垂直切片(systematic randomly positioned vertical sections),個(gè)切面是隨機(jī)的,其余切面則是與個(gè)切面或一定的角度而選擇的,如圖中(3)和(4)即表示三個(gè)不同的方向,但都垂直于同平面,即垂直切片互相間有一定的旋轉(zhuǎn)角度。圖9-7擺線測(cè)格中大箭頭所示vertical 表示箭頭方向與標(biāo)本垂直軸一致,即圖9-8中的verfical 所示方向。

如果有的標(biāo)本沒有可辨認(rèn)的垂直軸,可任意確定一個(gè)水平面,來作垂直切片。

 

圖9-7 示擺線測(cè)格

 

9-8 示垂直切片

VERTICAL:指垂直軸;

P:水平面;二個(gè)VP為垂直面,互相不呈平行關(guān)系

 

圖9-9 示管狀器官的垂直切片

六、實(shí)例介紹

因?yàn)閷⒚庖呒?xì)胞化學(xué)方法與圖像分析結(jié)合起來進(jìn)行研究的論文在國(guó)內(nèi)國(guó)外都還不多。在第六屆學(xué)術(shù)會(huì)議上發(fā)表的90多篇論文中只有1篇,因此在實(shí)例介紹中,包括一部分不是免疫細(xì)胞化學(xué)方法,而是用其他組織學(xué)方法與圖像分析結(jié)合起來研究,但這種方法對(duì)研究免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本也可借鑒,從中可得到一些啟發(fā)的,也在此選擇性地作一些介紹。

Mcmillan等1983年在第六屆體視學(xué)會(huì)議上曾報(bào)告了“用圖像信息處理機(jī)客觀評(píng)定免疫組織化學(xué)染色的組織”,闡明了當(dāng)組織與抗體作用時(shí),不斷攪動(dòng)血清,明顯提高了免疫反應(yīng)。Bordier 等1982年用圖像分析法對(duì)大鼠的神經(jīng)垂體進(jìn)行研究,闡明了軸突占神經(jīng)垂體體積的一半,分泌顆粒占軸突體積的20%,加壓素的含量與分泌顆粒的體積密度無關(guān),而與分泌顆粒內(nèi)激素濃度有關(guān)。這些結(jié)果如不用圖像分析法是很難得出的。Steward等1983年用測(cè)量家雞腦單位面積內(nèi)的突觸數(shù)目等,來研究與記憶形成有關(guān)的細(xì)胞學(xué)改變。

英國(guó)現(xiàn)在有300萬75歲以上的人,其中有五十萬人患有老年性癡呆(Alzheimer?。?,這種病過去認(rèn)為是由于年齡增長(zhǎng)的不可避免的現(xiàn)象。英國(guó)神經(jīng)科學(xué)所用圖像分析儀與谷氨酸鹽受體的放射自顯影法結(jié)合起來對(duì)此病進(jìn)行了重要的研究。由于放射自顯影會(huì)產(chǎn)生一些非特異性的結(jié)合,用圖像分析儀可以從全結(jié)合圖像減去非特異性結(jié)合圖像,而得到特異性結(jié)合圖像,可以測(cè)出特異性結(jié)合的百分率。目前已知道,老年性癡呆患者腦中,與記憶、理性行為及感情行為有關(guān)的區(qū)域內(nèi),神經(jīng)元的進(jìn)行性退變,神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生改變,影響了從一個(gè)神經(jīng)元到另一個(gè)神經(jīng)元的信息傳遞。

我國(guó)1991年11月出版的“計(jì)量學(xué)在形態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集“共收集論文123篇,其中有關(guān)免疫細(xì)胞化學(xué)與計(jì)量學(xué)結(jié)合的論文共8篇:①大鼠燙傷后下丘腦室旁核和視上核內(nèi)AVP含量變化的形態(tài)學(xué)計(jì)量(第二軍醫(yī)大學(xué)張忠義等)用圖像分析儀測(cè)定AVP陽性反應(yīng)物的面積。②人脊神經(jīng)節(jié) 內(nèi)SP、SK、CGRP免疫反應(yīng)細(xì)胞的比率(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)方秀斌等),用人工計(jì)數(shù)方法。③交感神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元中ACh和ChAT顯示比較(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院汪家政等),用圖像分析法測(cè)定各種參數(shù)。④大鼠脾樹狀突細(xì)胞的組織分布棗S—100蛋白標(biāo)記和立體計(jì)量分析(南京鐵道醫(yī)學(xué)院張錦堃等)用目鏡標(biāo)線片的測(cè)格進(jìn)行定量研究。⑤垂體GH腺瘤細(xì)胞分泌顆粒的免疫膠體金定位檢測(cè)及定量分析(中國(guó)人民總醫(yī)院羅毅等),用圖像分析法測(cè)定各種參數(shù)。⑥胃腸粘膜重度異型增生與腺癌細(xì)胞核DNA含量的測(cè)定及免疫組化的比較研究(上海第二醫(yī)科大學(xué)吳平平等),用顯微分光光度系統(tǒng)進(jìn)行DNA測(cè)量。⑦免疫組化在胃癌病理?xiàng)椛飳W(xué)分型中的價(jià)值(濱州醫(yī)學(xué)院張樹畢等),將免疫組化反應(yīng)分為陽性陰性而進(jìn)行比較。⑧人胎十二指腸EC細(xì)胞的體視學(xué)研究(江西醫(yī)學(xué)院朱清仙等)用目鏡標(biāo)線片測(cè)格進(jìn)行定量研究。由此可大致體現(xiàn)我國(guó)在此領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀。

七、圖像分析與體視學(xué)

圖像分析還可用于三維重建,用連續(xù)切片可重建立體的原形,在神經(jīng)組織的研究中很適用。我們?cè)陲@微鏡下觀察到的是平面圖像,而這些平面圖像是從立體結(jié)構(gòu)中切下來的,單憑平面圖像不能反映組織的真實(shí)結(jié)構(gòu),例如圓形可以從球形、圓柱形、橢圓形物體中切下。如何從二維結(jié)構(gòu)推導(dǎo)出三維結(jié)構(gòu),這就是所謂體視學(xué)(stereology)所研究的范疇。stereology 這個(gè)詞是1961年開始正式應(yīng)用的,由于體視學(xué)與圖像分析的密切關(guān)系,無論是上的或國(guó)內(nèi)的學(xué)術(shù)會(huì)議都將這二者放在一起討論。

將體視學(xué)知識(shí)與免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本觀察聯(lián)系起來,將是一種可以獲取更多信息的研究手段,目前國(guó)外已很重視體視學(xué)的研究方法,發(fā)表了一些論文,國(guó)內(nèi)也開始做這方面的工作,因此有必要將體視學(xué)的一些基本術(shù)語介紹給讀者,供參閱文獻(xiàn)時(shí)或自己進(jìn)行研究時(shí)應(yīng)用。體視學(xué)語言目前已是一種通用的術(shù)語,現(xiàn)將常用的介紹如下:

結(jié)構(gòu)(structure):在一個(gè)確定的組織模式中,由許多相互依賴的部分所組成的某物體稱為結(jié)構(gòu)。一個(gè)結(jié)構(gòu)至少有二個(gè)組分構(gòu)成,體視學(xué)的目的即弄清楚各組分之間相互關(guān)聯(lián)程度、相對(duì)大小等。

組分(component):在結(jié)構(gòu)中能被截然分開而且能被辨認(rèn)的部分。

相(phase):所有在本質(zhì)上相同的組分的集合稱為相。例如一個(gè)細(xì)胞的所有線粒體構(gòu)成了此細(xì)胞的線粒體相。

粒子(partiele):假如組分是由許多離散的并且能夠作為單元獨(dú)立存在的要素所組成,則將這些要素稱為粒子,粒子可以表現(xiàn)為各種形狀。

凸面體(convex solid):連接此實(shí)體內(nèi)任何兩點(diǎn)的線段,必需全部落于此實(shí)體內(nèi),換句話說,即此實(shí)體上切下的一個(gè)切片只能形成一個(gè)截面。

包容空間(containing space):指包含被研究的組分的空間。當(dāng)然,被研究的組分常與其他不被研究的組分并存。

密度(density):?jiǎn)挝惑w積、單位面積或單位長(zhǎng)度內(nèi)的量。

體積密度(volume density):在單位包容空間內(nèi),某相的體積。

表面積密度(surface density):?jiǎn)挝话菘臻g內(nèi)所含有某相的表面積。

長(zhǎng)度密度(length density):?jiǎn)挝话菘臻g內(nèi)某相的長(zhǎng)度。

數(shù)密度(numerical density):?jiǎn)挝话菘臻g內(nèi)某相的數(shù)目。

截面(profile):任何結(jié)構(gòu)的切片上的圖像。

體視學(xué)的測(cè)量值往往是相對(duì)測(cè)量值,以兩個(gè)彼此相關(guān)聯(lián)的測(cè)量值的比率來表達(dá),其中一個(gè)測(cè)量值與組分有關(guān),另一個(gè)測(cè)量值與包容空間在關(guān),后者也稱為“參考系統(tǒng)”。體視學(xué)原理可確定在切片上測(cè)得的這些比率與空間結(jié)構(gòu)內(nèi)相應(yīng)的比率之間的關(guān)系。上述性質(zhì)反映在體視學(xué)符號(hào)中,而這些符號(hào)目前已普遍被使用,在有些文獻(xiàn)中已不再作解釋了。常用的符號(hào)如下:

P測(cè)試點(diǎn)數(shù)

P1單位測(cè)試線長(zhǎng)上的交點(diǎn)數(shù)

Pa單位測(cè)試面積上的點(diǎn)數(shù)

Pv單位測(cè)試體積上的點(diǎn)數(shù)

L測(cè)試線長(zhǎng)

L1單位測(cè)試線長(zhǎng)上的截距

La單位測(cè)試面積上線的單元長(zhǎng)

Lv單位測(cè)試體積上線的單元長(zhǎng)

A測(cè)試面積

S表面積

Aa單位測(cè)試面積上被測(cè)物的面積

Sv單位測(cè)試體積內(nèi)被測(cè)物的表面積

V體積

Vv單位測(cè)試體積內(nèi)被測(cè)物的體積

N被測(cè)物數(shù)目

N1 單位測(cè)試線長(zhǎng)上與被測(cè)物相交的數(shù)

NA單位測(cè)試線長(zhǎng)上與被測(cè)物的數(shù)

Nv單位測(cè)試體積內(nèi)被測(cè)物的數(shù)

用測(cè)試網(wǎng)格的體視學(xué)方法,楊光等,1987年曾對(duì)腹腔神經(jīng)節(jié) 小強(qiáng)熒光細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的定量分析,測(cè)量了線粒體、溶酶體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、顆粒小泡的Vv、Sv、Na、Nv等參數(shù),得出了標(biāo)準(zhǔn)小強(qiáng)熒光細(xì)胞的計(jì)量值。此處的Vv即單位體積細(xì)胞質(zhì)內(nèi)某種細(xì)胞器的體積,據(jù)體視學(xué)原理,Vv等于切片上被測(cè)的某種細(xì)胞器所占的面積的均數(shù)a與細(xì)胞質(zhì)的面積的均數(shù)A之比,如用圖像分析儀即可得出此二者的面積,而用測(cè)試格a等于落在此細(xì)胞器上的測(cè)試格的交點(diǎn)總數(shù)∑Pi,A等于落在細(xì)胞質(zhì)上的測(cè)試格交點(diǎn)總數(shù)∑Pc。

Vv=?。疉=∑Pi/∑Pc

測(cè)試格的交點(diǎn)數(shù)有各種規(guī)格,如果有20條橫測(cè)試線與20條縱測(cè)試線組成的測(cè)試網(wǎng)格,則有400個(gè)交點(diǎn),利用交點(diǎn)所落部位進(jìn)行推算。

免疫組織化學(xué)形態(tài)計(jì)量研究中參照空間的“陷井”問題。在某種組織結(jié)構(gòu)(參照空間)內(nèi)測(cè)量特征物的密度值(如體積分?jǐn)?shù)、表面積密度、長(zhǎng)度密度、數(shù)目密度等),如果不知道參照空間的體積,得不到值,就有可能作出錯(cuò)誤的結(jié)論,就是參照空間的“陷井”。舉一例子說明:實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)大鼠肝細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的體積分?jǐn)?shù)和表面積密度無顯著差異,如果依此就認(rèn)為苯巴妥對(duì)肝細(xì)胞(參照空間)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無顯著影響,就錯(cuò)了,就進(jìn)入了參照空間的“陷井”中去了。實(shí)際上,在些實(shí)驗(yàn)條件下,肝細(xì)胞質(zhì)總體積顯著增加,因而雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的體積分?jǐn)?shù)和表面積密度無顯著差異,但其值已顯著增加了。因此,要測(cè)量或估計(jì)參照空間的體積、乘以密度值,獲得值,才能獲正確的結(jié)論。

八、國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)圖像分析儀的情況簡(jiǎn)介

(一)國(guó)內(nèi)情況

80年代初,以IBM—PC為代表的個(gè)人計(jì)算機(jī)得到了突飛猛進(jìn)的大發(fā)展和在普及;緊接著各種功能強(qiáng)大面向圖像處理與分析的超大規(guī)模(VLSI)蕊片或單板達(dá)到商品化水平,兩者的結(jié)合,為微機(jī)圖像處理系統(tǒng)的問世奠定了硬件基礎(chǔ)。打破了以往只能在大中型計(jì)算機(jī)加圖像處理系統(tǒng)的構(gòu)成價(jià)格昂貴的圖像處理系統(tǒng)的局面。為推廣圖像處理與分析技術(shù)創(chuàng)造了物質(zhì)基礎(chǔ)。從80年代中期開始,國(guó)內(nèi)先后有武漢大學(xué)、清華大學(xué)、中科院自動(dòng)化所、計(jì)算所、重慶大學(xué)、四川大學(xué)、華北計(jì)算所等單位,紛紛進(jìn)行微機(jī)圖像處理與分析系統(tǒng)的研制和推廣應(yīng)用工作。其中以四川大學(xué)計(jì)算機(jī)系圖像圖形研究所研制開發(fā)并定型生產(chǎn)的MIAS系列圖像分析儀在國(guó)內(nèi)具有較大的優(yōu)勢(shì),獲得了1992年新產(chǎn)品證書。

現(xiàn)介紹如下:MIAS系列圖像分析儀包括偽彩色型MIAS—300,真彩色型MIAS—400,超高分辨率型MIAS—1000等面向生物醫(yī)學(xué)、金相分析、石油地質(zhì)以及其它目的的各種圖像儀均由硬件系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)兩大部分構(gòu)成。硬件系統(tǒng)主要包括MIAS圖像處理計(jì)算機(jī)、圖像輸入設(shè)備,圖像輸出設(shè)備和交互式處理設(shè)備等。其主要性能指標(biāo):圖像分辨率512×512,640×480,1280×1024。圖像采集速度:電視方式0.04s/幀,慢速高精方式2~10秒/幀。圖像存儲(chǔ)體:MIAS—3000.5MB~1.5MB(兆字節(jié) ),MIAS—4001.5MB~4.5MB,MIAS—1000 2MB~10MB ?;叶鹊燃?jí):256或4096。圖像處理器特性:IPU40MHZ主頻,>10MIPS。IFU(圖像浮點(diǎn)處理器)40MHZ主頻,>4MFOPS(每秒兆浮點(diǎn)處理指令)。在各種圖像輸入設(shè)備中,以視頻攝像機(jī)為圖像的基本輸入設(shè)備,也可以配接視頻錄像機(jī)、數(shù)字掃描儀和連接掃描電鏡的接口。高分辯彩色監(jiān)示器為圖像的基本輸出設(shè)備。該系統(tǒng)還具備有自動(dòng)移位的載物臺(tái)和自動(dòng)聚集控制系統(tǒng)可供用戶選擇。MIAS系列圖像分析儀的軟件系統(tǒng)是在DOS(磁盤操作系統(tǒng))3.2以上環(huán)境開發(fā)的,全部采用C語言和匯編語言(80286宏匯編,TMS340系列匯編)進(jìn)行編程,共98個(gè)功能模塊。主要功能包括初始化及環(huán)境設(shè)置、圖像輸入和輸出、圖像編輯、圖像增強(qiáng)、圖像分割、圖像測(cè)量、實(shí)用程序等。測(cè)量參數(shù)包括一維和二維目標(biāo)的各種形態(tài)參數(shù),灰度參數(shù)和紋理參數(shù)等數(shù)十種。該系統(tǒng)在長(zhǎng)期為華西醫(yī)科大學(xué)、和第四軍醫(yī)大學(xué)、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、上海醫(yī)科大學(xué)、湖南醫(yī)學(xué)院、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)等數(shù)十個(gè)醫(yī)學(xué)單位的服務(wù)中,積累了許多有效的實(shí)用算法和功能、用戶界面和處理速度方面已達(dá)到和超過某些進(jìn)口中圖像儀的水平。

(二)國(guó)外情況

英國(guó)的主要生產(chǎn)廠家有劍橋儀器公司(Cambridge Instruments Company),在圖像的測(cè)量、計(jì)算、比較、分類等功能上都比過去的產(chǎn)品更完善,使用了大功率的新型計(jì)算機(jī),使用QUIPS程序可獲得各種圖像分析測(cè)量的數(shù)據(jù),重現(xiàn)性好。操作者不必精通程序設(shè)計(jì)語言,只需接受幾小時(shí)使用QUIPS語言的教學(xué)訓(xùn)練即可。

英國(guó)Ealing—Beck公司生產(chǎn)Histotrak圖像分析系統(tǒng),如用透射光,該儀器能自動(dòng)改變放大倍數(shù)。具有陰影校正系統(tǒng)。使研究工作者感興趣的是該儀器中設(shè)有坐標(biāo)發(fā)生器,能使被檢圖像的坐標(biāo)數(shù)據(jù)通過臺(tái)式計(jì)算機(jī)在輸出打印機(jī)上打印出來。

英國(guó)Micro Measurements 公司生產(chǎn)電視掃描圖像分析儀,成本較低,用途較多。

英國(guó)Joycez—Loebl公司生產(chǎn)Magiscam圖像分析系統(tǒng),操作較簡(jiǎn)單,可解決一般圖像分析問題,并可進(jìn)行彩色圖像分析,在醫(yī)學(xué)和放射學(xué)等方面適用。

美國(guó)的主要廠家有美國(guó)美敦設(shè)備公司(Milton Roy Company),生產(chǎn)OMNICON圖像分析儀,據(jù)上海多國(guó)儀器儀表展覽會(huì)資料介紹,Ommicon圖像分析系統(tǒng)有Omnicon Alpha500用于常規(guī)檢驗(yàn)和研究。Ommicon FAS—III 用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域較合適。Omnicon 3500為一種多用途的系統(tǒng),配有64K通用NOVA4×計(jì)算機(jī)。Omnicon 5000是該公司發(fā)展的使用起來方便的定量圖像分析儀。Omnicon 7500是為了對(duì)圖像作實(shí)時(shí)分析而設(shè)計(jì)的產(chǎn)品。

德國(guó)Leitz公司制造Leitz T.A.S圖像分析儀,圖像輸入裝置是一臺(tái)Leitz Orthplan顯微鏡,該儀器還包括一臺(tái)TU—58雙盒式磁帶機(jī),可用于存貯程序、數(shù)據(jù)、圖像。該公司產(chǎn)品的新型號(hào)是Leitz T.A.S PLUS,增加了自動(dòng)調(diào)焦、自動(dòng)圖像旋轉(zhuǎn)等功能。

德國(guó)Carl Zeiss公司的產(chǎn)品是Micro—Videomat,主要優(yōu)點(diǎn)是有適用于計(jì)算機(jī)和大型計(jì)算機(jī)的程序。型號(hào)有Micro Videomat 2型、3型等。

德國(guó)的OPTON公司生產(chǎn)IBAS2000圖像分析系統(tǒng),可應(yīng)用于顯微圖像分析的所有領(lǐng)域,如放射自顯影、染色體分析、真色圖像信息、細(xì)胞學(xué)分析、用連續(xù)切片來重建原形、顆粒大小分析、纖維分析、可測(cè)定交叉的或重疊的纖維長(zhǎng)度及纖維的長(zhǎng)/寬比例等。

德國(guó)VEB Zeiss Jena公司生產(chǎn)EPIQUANT圖像分析儀,可進(jìn)行自動(dòng)或半自動(dòng)分析。

日本浜板電視公司生產(chǎn)一系列特殊用途的、測(cè)量特殊參數(shù)的自動(dòng)分析系統(tǒng),如其中有一種稱為Multianalyser的,與顯微鏡相結(jié)合,可用來測(cè)面積、長(zhǎng)度等。

對(duì)國(guó)內(nèi)外資料收集比較局限,總之購(gòu)置儀器時(shí)要充分了解性能、對(duì)價(jià)格作比較、才能獲得滿意的結(jié)果。

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