想要長期持有一個細(xì)胞系，策略是進(jìn)行低溫保存。這可以有效防止因污染或技術(shù)原因?qū)е碌募?xì)胞損失。而低溫保存對于維持細(xì)胞株的遺傳特性也極為重要。
 
看似簡單的凍存細(xì)胞，如果操作不當(dāng)，將導(dǎo)致長期培養(yǎng)的細(xì)胞付之東流。作為一個吃過虧的人，告訴你細(xì)胞凍存是否成功取決于以下四個關(guān)鍵因素（文章結(jié)尾有福利，等不及的小伙伴可以拉至底部）。
 
一、適當(dāng)?shù)奶幚砑皽睾褪占?xì)胞
 
凍存前檢查
 
凍存前，細(xì)胞應(yīng)處于指數(shù)生長期，確保細(xì)胞處于健康狀態(tài)。理想情況下，應(yīng)在收獲細(xì)胞前 24 小時更換培養(yǎng)基。建議對培養(yǎng)物進(jìn)行微生物污染物，特別是支原體的檢測，并通過適當(dāng)?shù)姆椒?，?STR 分析確定其身份。
 
如果在培養(yǎng)過程中使用抗生素，那么建議在冷凍前 1 到 2 周不使用抗生素，這樣如果出現(xiàn)污染，可以更容易地發(fā)現(xiàn)。
 
收集細(xì)胞
 
通常，您可以使用常規(guī)用于細(xì)胞傳代的實驗程序來收獲細(xì)胞。細(xì)胞收獲期間盡可能溫和操作。本程序推薦的試劑量是針對為 75 平方厘米（T-75）培養(yǎng)瓶；若使用其他培養(yǎng)容器，請相應(yīng)調(diào)整所用試劑量。
 
1. 使用無菌吸管，取出并丟棄培養(yǎng)基。請妥善處置與細(xì)胞接觸的任何材料和溶液。
 
2. 用 5 到 10 ml CMF-PBS 沖洗細(xì)胞，去除所有痕量的血清。
 
3. 加入 3 到 5 ml 的胰酶（在 CMF-PBS 中），37℃ 孵育。預(yù)熱酶溶液通常會縮短處理時間。
 
4. 在倒置相差顯微鏡上每隔幾分鐘檢查酶處理的進(jìn)展情況。一旦細(xì)胞變圓，輕輕敲擊細(xì)胞瓶使其脫離塑料表面。加入 5 ml 含血清的生長培養(yǎng)基滅活胰酶。可能需要劇烈的移液操作來使培養(yǎng)容器底部的剩余細(xì)胞脫落，或?qū)⒓?xì)胞團(tuán)塊分解成單細(xì)胞懸浮液。胰酶的去除或失活對于冷凍細(xì)胞至關(guān)重要。如果游離試劑不能直接滅活，可以通過下一步的離心去除。
 
5. 用 15ml 離心管收集細(xì)胞。取出樣本進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，剩余的細(xì)胞懸液以約 100×g 離心 5 分鐘以獲得細(xì)胞沉淀。離心時，用細(xì)胞計數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。使用臺盼藍(lán)染液檢查細(xì)胞的活性。
 
二、使用合適的冷凍保護(hù)劑
 
5%～10% 的甘油和 DMSO 是常見的凍存保護(hù)劑。雖然 DMSO 對細(xì)胞有毒性，但是與甘油相比，其滲入細(xì)胞的速度更快，而且凍存重復(fù)性更好（細(xì)胞復(fù)蘇效率更好）。
 
但是，DMSO 一方面會導(dǎo)致某些細(xì)胞（如 HL-60 早幼粒細(xì)胞）分化，另一方面對某些細(xì)胞（如 HBE4-E6/E7 肺上皮細(xì)胞）的毒性也過大。對于這些細(xì)胞，則應(yīng)使用甘油。甘油可以通過高壓蒸汽滅菌，而 DMSO 只能通過過濾除菌。DMSO 或者甘油至少應(yīng)達(dá)到試劑級（或者更別，如細(xì)胞培養(yǎng)級），并且分裝，避光保存。
 
三、細(xì)胞凍存的速率
 
有很多方法可以實現(xiàn) 1℃/min 的降溫速度。電腦控制的可編程電子降溫系統(tǒng)是的方式，可以保持降溫速度。這也是 ATCC 采用的方法。但這種設(shè)備價格較高。比較經(jīng)濟(jì)的方式是將凍存管放置于凍存盒中，在低于 –70℃ 的冰箱中凍存 24 小時。已有一些商業(yè)化凍存盒產(chǎn)品能夠非常接近 1℃/min 的理想降溫速度。
 
四、合適的儲存溫度
 
長期保藏需要超低溫（低于 -130℃）環(huán)境，可以使用低溫冰箱，更普遍的方法是保存在液氮罐中。
 
要維護(hù)液氮中儲存的細(xì)胞需要記住以下幾點：
 
1. 確保標(biāo)簽系統(tǒng)適用于低溫儲存。
 
2. 保持良好記錄，包括細(xì)胞儲存位置，生長特點和操作記錄。
 
3. 請頻繁檢查液氮罐的狀態(tài)（每天或至少每周一次）。有多種商用警報系統(tǒng)可用于持續(xù)監(jiān)控其狀態(tài)。珍貴細(xì)胞應(yīng)至少存放在兩個不同的地點。
 
 
后，關(guān)于養(yǎng)細(xì)胞這件小事，還想提醒大家一句：如果你購買了 ATCC 細(xì)胞系，為了保證培養(yǎng)基一致性的問題，購買細(xì)胞時，一起購買推薦培養(yǎng)基。因為來自于不同廠家的培養(yǎng)基，即使名字相同或類似，配方也略有差異。