角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理    將角膜組織置于膠原蛋白上，使其附著。然后，在涂有纖連蛋白和膠原蛋白的培養(yǎng)皿擴(kuò)增培養(yǎng)。
試劑、試劑盒    D-PBSA無血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液 胰蛋白酶 EDTA Biocoat6孔培養(yǎng)板
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、材料 

滅菌

無血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液（keratinocyteserum-freemedium，KGM;Clonetics): 含有 0.15 mmol/LCa2-、0.1ng/ml 人上皮生長因子、5ug/ml 胰島素、0.5ug/ml  30ug/ml 牛垂體提取物。

EMEM(Eagle'sminimalessentialmedium)

D-PBSA：不含 Ca2+和 Mg2+的 DulbeccoPBSA 液 FBS

胰蛋白酶和 EDTA 混合液：0.05% 胰蛋白酶，0.5 mmol/L EDTA
纖連蛋白和膠原蛋白混合液（fibronectin/collagen，F(xiàn)NC)：10ug/ml 纖連蛋白、35ug/ml 膠原蛋白和 lOOug/mlBSA。BSA 作為穩(wěn)定劑

Biocoat 6 孔培養(yǎng)板：涂有鼠尾 I 型膠原蛋白（B-D Biosciences)

二、操作步驟 
 
原代培養(yǎng) 

1. 將供體角膜放于消毒過的物品上，上皮面朝上，用手術(shù)刀切成 12 個(gè)三角形組織片。應(yīng)一刀切下去，避免鋸割。如此仔細(xì)處理角膜可減少對(duì)膠原蛋白基質(zhì)的破壞和成纖維細(xì)胞的脫落。

2. 將角膜組織片的上皮面翻向下，放入用鼠尾 I 型膠原蛋白預(yù)涂的 6 孔培養(yǎng)板，每孔放 4 個(gè)組織塊。

3. 用鑷子輕壓組織片，以便使組織塊與培養(yǎng)皿表面充分接觸。將組織片放置 20 min，使其變干。

4. 將一滴 KGM 輕輕滴于組織片上，在 37°C 和 5%CO2 條件下孵育過夜。盡管從眼庫得到的供體角膜是用含有抗菌素的培養(yǎng)液（McCarey-Kauffman 或 Dexsol) 保存的，但全部操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。

5. 第 2 天，在培養(yǎng)皿中加人 lml 培養(yǎng)液。在培養(yǎng)早期，可觀察到細(xì)胞僅從角膜緣處遷出，但沒有細(xì)胞從角膜中央部或鞏膜遷出。無血清培養(yǎng)液含有低濃度鈣（0.15 mmol/L)，減少膠原蛋白基質(zhì)降解，故這種培養(yǎng)液可減少成纖維細(xì)胞長出。

6 在植入角膜組織片后第 5 天，用鑷子將組織片取出，再加人 3 ml 培養(yǎng)液。取出組織片后，貼壁細(xì)胞繼續(xù)增殖。培養(yǎng)后第 2 周，細(xì)胞生長形成單層，呈現(xiàn)上皮具有的典型卵石狀排列特征。每個(gè)角膜約獲得 1X106?5X106 個(gè)上皮細(xì)胞。
 
擴(kuò)增培養(yǎng)
 
7. 取出組織片后，每周換液 2 次。
 
8 當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá) 70%?80% 時(shí)，用 D-PBSA 浸洗細(xì)胞。然后，在 37°C 條件下用胰蛋白酶和 EDTA 混合液處理 4 min。
 
9. 用含有 10% FBS 的 D-PBSA 終止消化。
 
10 將細(xì)胞離心后，用 KGM 混懸。計(jì)數(shù)細(xì)胞，以 1X104 個(gè)/cm2 密度將細(xì)胞接種于涂有 FNC 的培養(yǎng)皿。
 
11 在 37°C、95% 空氣和 5%CO2 條件下培養(yǎng)。
 
12. 胰蛋白酶處理和種植 1d 后換培養(yǎng)液。

傳代后不久，上皮細(xì)胞呈長梭形，折光，遷移能力較強(qiáng)。傳代后第 1 周，細(xì)胞匯合達(dá) 70%?80% 時(shí)呈卵石狀排列。如果形成單層后繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞能生長成散在的復(fù)層結(jié)構(gòu)。

盡管角膜上皮細(xì)胞能傳至 5 代，約倍增 9?10 倍，但大多數(shù)細(xì)胞增殖發(fā)生在第 1?3 代。每個(gè)角膜約獲得 1X106?2X106 個(gè)上皮細(xì)胞。細(xì)胞常在第 5 代開始衰老。