神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)實驗實驗方法原理    
神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)是盡 量 創(chuàng)造適合于各類神經(jīng)細(xì)胞生長的體外環(huán)境，獲得狀態(tài)良好，純度較高細(xì)胞的方法 。 腦部組織來源的各種神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)具有相似的取材過程和部分通用的培養(yǎng)條件。

實驗材料    動物組織
試劑、試劑盒    消化液(0.25%胰蛋白酶+O.04%的EDTA)*培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清＋雙抗）D-PBS液多聚賴氨酸（包被濃度1OOµg ml)滅菌超純水殯伏75%酒精
儀器、耗材    體視顯微鏡相差顯微鏡精細(xì)器械（彎鑷、直鑷、虹膜剪、75%酒精消毒）眼科器械（彎鑷、直鑷、剪刀共3套高壓消毒）各種規(guī)格細(xì)胞培養(yǎng)瓶和皿（均來自Nunc公司）彎頭滴管1ml刻度滴管15ml離心管100mm玻璃皿200目細(xì)胞篩網(wǎng)低溫冰袋
實驗步驟    
除動物消毒以外，其他步驟都在超凈臺內(nèi)進(jìn)行 。

1. 動物的消毒：根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的類型和要求不同，常用胎鼠和新生鼠做神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng) 。 消毒方法分別如下 。

(1) 孕鼠操作 孕鼠經(jīng)麻醉后，以棉球蘸碘伏擦拭腹部毛皮消毒 。 擦拭從中心向外方向進(jìn)行，可更換棉球 1- 2次，面積盡量大一些，包括整個腹部和外生殖器周圍 。 用第 1 套解剖器械打開動物腹腔，換第 2 套器械分離子宮并置于含冷 D ­PBS 的 100mm 玻璃皿中，再換第 3 套器械在每只胎鼠的間隔處剪開子宮并剝離出胎鼠 。

(2) 仔鼠操作 仔鼠（新生 7d 以內(nèi)）直接浸泡于冰的 75%酒精中， -20℃冰箱低溫消毒 10min 左右，動物失去知覺即可開始取材 。

2. 皮層組織的分離：新生鼠使用眼科剪將動物斷頭，并用鑷子剝除頭部的皮膚 。在冰 D -PBS 液中沿顱骨人字縫從后向前剝離 。 一般左手持彎鑷，在動物兩眼處以適當(dāng)力度固定；右手持直鑷，完成剝除皮膚 、 骨骼以及分離組織等工作 。 在顯微鏡下利用精細(xì)器械分離皮層或海馬時，沿皮層邊緣以 45° 角小心劃開，并逐步使之剝離，轉(zhuǎn)移組織入盛有冰 D - PBS 液的 35mm 小皿中；然后用精細(xì)器械仔細(xì)去除每個皮層或海馬的腦膜（整個過程需要在低溫冰袋上完成） 。

3.組織的分散；用管口較粗的彎頭滴管吸去帶有腦膜的 D - PBS, 盡去除干凈液體并避免吸走組織；用虹膜剪將組織逐撮均勻剪成乳糜狀，使組織塊為 lmm3 的大小為宜 。 加入合適體積的消化液（－般蓋過組織塊并且可以隨意搖晃即可），并均勻分散組織，放入37°C 孵育箱中消化約 15min (每間隔 3 -5min 用手輕輕搖晃1次，動物胎齡越小，越容易分散，消化時間可相應(yīng)縮短） 。

4. 單細(xì)胞懸液的制備!用口徑較粗的彎頭滴管將消化好的組織吸入含 3 - 5ml 冰的*培養(yǎng)基的 10ml 離心管中，靜置 5min 左右 。 用同樣的滴管將沉底的組織轉(zhuǎn)移到另 一個含約 5ml 冰的*培養(yǎng)基的 10ml 離心管中，并開始吹打 。 吹打時每次不超過 15 次，先用粗口徑的彎頭滴管吹散，靜置片刻后將上清用細(xì)口徑彎頭滴管轉(zhuǎn)移至另 一個離心管中，并再吹打 15 次左右 。 在原先含沉淀的離心管中再加入*培養(yǎng)基繼續(xù)吹打，并收集上清重復(fù)上述過程 。 反復(fù)吹打幾次后，組織塊基本消失，將全部上清過 200 目篩網(wǎng)以去除剩余組織塊并收集、計數(shù) 。 離心 (900r/min, 5min) 去除細(xì)胞碎片并將細(xì)胞重懸至合適的體積，以備后用 。
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注意事項    
1.在做原代之前準(zhǔn)備工作一定要做好，提前配好液體。整個操作過程注意無菌，且培養(yǎng)液中如無特殊說明，均含有青－鏈霉素（雙抗）。

2.動物消毒應(yīng)在遠(yuǎn)離超凈工作臺的區(qū)域完成，成年動物尤其要注意。

3.組織取材過程全部在低溫環(huán)境中進(jìn)行，可大大提高細(xì)胞存活；而且整個過程不宜太久，否則細(xì)胞活性明顯降低。

4.在組織分散過程中，一般3只左右動物來源的皮層在一個小皿中剪碎消化，不宜在同一個小皿中處理過多的組織。

5.吹打細(xì)胞用的彎頭滴管一定要事先經(jīng)火焰拋光，否則細(xì)胞極易受傷而死亡；而且吹打細(xì)胞懸液時盡量避免產(chǎn)生過多氣泡，可以提高細(xì)胞的存活。

6.基本上原代培養(yǎng)的各種神經(jīng)細(xì)胞都需要生長在經(jīng)特殊物質(zhì)處理過的培養(yǎng)介質(zhì)上，比如多聚賴氨酸、層黏連蛋白等
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其他    
實驗心得：

1.大鼠和小鼠來源的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)方法大致上相同，除特殊提到以外，基本可以通用。2.去除腦膜時，一般左手持懾輕柔固定組織，右手負(fù)責(zé)剝離。整塊腦膜一同被剝離后，往往細(xì)胞培養(yǎng)物中的成纖維細(xì)胞污染較少。

3.胰酶消化液處理后的組織往往發(fā)黏，這是細(xì)胞釋放出DNA的原因。這并不會影響消化效果，而且可以在后面的吹打過程中去除。對于初學(xué)者，可以通過在消化液中加入DNA酶的方法提高終細(xì)胞的產(chǎn)量。

4.在胰酶消化液中加入EDTA有利于組織細(xì)胞團分散成單細(xì)胞，終止EDTA的作用主要依靠稀釋以降低其濃度。來源：《神經(jīng)生物學(xué)實用實驗技術(shù)》第四軍醫(yī)大學(xué)出版社