實驗方法原理    胰蛋白酶消化后，用 EDTA 分散從皮膚片分離的表皮片，然后用添加 bFGF（FGF-2）的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。
實驗材料    D-PBSA胎牛血清大豆胰蛋白酶抑制劑
試劑、試劑盒    添加激素的黑素細胞培養(yǎng)液胰蛋白酶和EDTA混合液
儀器、耗材    組織培養(yǎng)皿吸管離心管濕潤的培養(yǎng)箱水浴箱電子細胞計數(shù)儀或血細胞計數(shù)板
實驗步驟    
原代培養(yǎng)

第 1 天

1. 用 70 % 乙醇浸洗皮膚標本，然后用 D-PBSA 浸洗 2 次。

2. 將組織移入無菌 100 mm 培養(yǎng)皿，表皮面朝下。

3. 用解剖剪除去皮下脂肪和深部。

4. 將剩余的組織用手術(shù)刀切成 2 mm × 2 mm 小塊。刀片在組織上搖動，但不要采用鋸切。

5. 將組織塊移入盛有冷的 0.25 % 胰蛋內(nèi)酶的 15ml 離心管。

6. 在室溫條件下，將組織塊孵育 60~90 min 。對于某些供體的皮膚，先在 4°C 條件下孵育 18~24 h，然后在 37°C 條件下孵育 1~2 h，這樣可獲得較多的黑素細胞。

第 2 天

7. 輕拍離心管，使沉于底部的組織塊移動。然后，將離心管內(nèi)的內(nèi)容物快速倒入 60 mm 培養(yǎng)皿。

8. 用手術(shù)鑷將組織塊逐一地移入 100 mm 干培養(yǎng)皿，上皮面朝下。輕輕搖動組織塊，使其接觸培養(yǎng)皿底壁。應使表皮層附著在培養(yǎng)皿上，以便用手術(shù)鑷*分離。除去片。

9. 將表皮片移入盛有 5 ml 0.02% EDTA （0.7 mmol/L）的 15 ml 離心管。注意將表皮片放入 EDTA 液，不要貼在離心管壁上。

10. 輕輕搖晃離心管，使表皮片分散成單細胞。

11. 離心（350 g，5 min），然后吸去上清液。

12. 用 MHSM 混懸細胞。

13. 用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，然后在 35 mm 培養(yǎng)皿用 2 ml 含有 5 % FBS 的 MHSM 孵育細胞，細胞密度為1×106 個（約2×104~4×104 個黑素細胞）。FBS 促進細胞貼壁。

14. 用含有生長因子和牛垂體提取物的 MHSM 換液，每周 2 次。

第 3~30 天

15. 培養(yǎng) 24 h 后，培養(yǎng)的細胞中含有原代角質(zhì)形成細胞和散在的黑素細胞。角質(zhì)形成細胞在幾天后停止增殖，角質(zhì)形成細胞克隆在第 2 周浮起。第 2 周末，只剩有黑素細胞。在大多數(shù)情況下，細胞在 2~4 周內(nèi)生長接近匯合，此時準備傳代。

代。



傳代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)

16. 用 0.02% EDTA（0.7 mmol/L）輕輕浸洗細胞 2 次。

17. 加入 3 ml 0.25 % 胰蛋白酶和 0.1 % EDTA（2.5 mmol/L）混合液，在 37°C條件下孵育。每 5 min 在相差顯微鏡下觀察 1 次，檢査細胞的去附著情況。

18. 當大多數(shù)細胞去附著時，用 10 μg/ml 大豆胰蛋白酶抑制劑或 1 ml 含有小牛血清的培養(yǎng)液使胰蛋白酶失活。傳代時，“血淸刺激”有益于在無血清條件下維持黑索細胞生長。

19. 吹打培養(yǎng)皿中的細胞，保證全部黑素細胞去附著。

20. 吸出細胞懸液，離心（350 g，5 min )。

21. 吸去上淸液，用含有 5 % FBS 的無鈣黑索細胞培養(yǎng)液混懸細胞。每個 100 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)放入 2×104~ 4×104 個細胞。黑素細胞很好地貼于塑料培養(yǎng)皿（> 75 % ) 要 FBS。但是，如果培養(yǎng)皿涂有纖連蛋白或 Ⅰ 型膠原蛋白和 Ⅲ 型膠原蛋白混合物，可不用 FBS [  Gilchres te al.，1985 ] 。

22. 用無血清或含有血淸的黑素細胞培養(yǎng)液換液，每周 2 次。用含有血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)能獲得較多的細胞，但含有血淸的培養(yǎng)液促進成纖維細胞的生長。將 Ca2＋ 濃度降至 0.03 mmd/L 不影響黑素細胞的增殖，但抑制成纖維細胞的過度生長 [ Naeyaert et al.，1991 ]。

添加激素的黑素細胞培養(yǎng)液（melanocyte hormone-supplemented medium，MHSM）：

(a)199 培養(yǎng)液（400-1200，GIBCO）：93.1 ml；

(b)EGF（B-D Biosciences）：0.1 ml，儲存濃度為 10 μg/ml，終濃度為 10 ng/ml；

(c)轉(zhuǎn)鐵蛋白（Sigma）：0.1 ml，儲存濃度為 10 mg/ml，終濃度為 10 μg/ml；

(d)胰島素（Sigma）：0.1 ml，儲存濃度為10 mg/ml，終濃度為 10 μg/ml；

(e)三碘甲狀腺原氨酸（Sigma）：0.1 ml，儲存濃度為 1 μmol/L，終濃度為 1 nmol/L；

(f)氧化可的松（Calbiochem）：0.5 ml，儲存濃度為 0.28 mmol/L，終濃度為 1.4 μmol/L；

(g)霍亂毒素（Calbiochem）：1.0 ml，儲存濃度為 1 μmol/L，終濃度為 1 nmol/L?？捎门４贵w提取物和雙丁酸環(huán)腺背酸代替霍亂毒素。牛垂體提取物（Clcmetics）的儲存濃度為 35 μg/ml，終濃度為 0.7 ng/ml。雙丁酸環(huán)腺汗酸（Sigma）的儲存濃度為 1 mmol/L，終濃度為 100 μmol/L；

(h)bFGF（Amgen）：5.0 ml，儲存濃度為 200 ng/ml，終濃度為 10 ng/ml。