骨髓造血細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)方法原理    將骨髓吸入培養(yǎng)液。作為附著的多層細(xì)胞，骨髓至少維持 12 周，可達(dá) 30 周。干細(xì)胞、趨向成熟的骨髓細(xì)胞和成熟骨髓細(xì)胞從附著的細(xì)胞層釋放入培養(yǎng)液。粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的祖細(xì)胞可用軟凝膠培養(yǎng)檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)材料    小鼠
試劑、試劑盒    Fischer培養(yǎng)液生長(zhǎng)培養(yǎng)液
儀器、耗材    注射器紗布拭子解剖剪解剖鑷培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟    
1. 斷頸處死小鼠（ 5 只小鼠：（C57BI/6×DBA/2）F1 骨髓的長(zhǎng)期培養(yǎng)效果好，但一些種系的骨髓的培養(yǎng)效果不佳，如 CBA [ Greenberger，1980 ]）。

2. 用 70 % 乙醇泡濕毛發(fā)，切除兩側(cè)股骨。將 10 塊股骨放人盛有 Fischer 培養(yǎng)液（含有 16 mmol/L（1.32 g/L）NaHCO3，添加50 U/ml 青霉素和 50 μg/ml 鏈霉素）的 Petri 培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿放在冰上。1 塊股骨含有 1.5×107~2.0×107 個(gè)有核細(xì)胞。

3. 在層流超凈工作臺(tái)操作：

(a)用紗布和拭子清除剩余的肌組織。

(b)用解剖鑷固定股骨，切斷膝關(guān)節(jié)端。21G 針頭應(yīng)能緊緊地插人骨髓腔。

(c)切斷股骨的另一端，盡量靠近末端。

(d)將股骨的一端插入盛有生長(zhǎng)培養(yǎng)液的 100 ml 瓶?jī)?nèi)，抽出和推壓注射器活塞數(shù)次，直至將股骨內(nèi)的骨髓沖洗出來(lái)。

(e)重復(fù)操作步驟 (a)~(d)，取出另外 9 塊股骨內(nèi)的骨髓。

4. 用 10 ml 吸管吹打大的骨髓團(tuán)塊，使骨髓分散成細(xì)胞懸液。

5. 按 10 ml 等量將細(xì)胞懸液分放入 25 cm2 培養(yǎng)瓶。不斷搖晃細(xì)胞懸液，以便保證將細(xì)胞均勻地分到 10 個(gè)培養(yǎng)瓶中。

6. 向培養(yǎng)瓶中充入 5 % CO2，然后擰緊蓋。

7. 在 33°C 條件下，橫置培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)細(xì)胞。

8. 每周換液 1 次。

(a)輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使附著不牢固的細(xì)胞懸起。

(b)吸去 5 ml 含有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液。注意吸管不要觸到附著細(xì)胞層。

(c)向每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入 5 ml 生長(zhǎng)培養(yǎng)液（生長(zhǎng)培養(yǎng)液：分裝為 100 ml。Fischer 培養(yǎng)液，添加 1×10-6 mol/L 和丁二酸鈉以及 20 % 馬血清。將和丁二酸鈉用 Fischer 培養(yǎng)液配制成儲(chǔ)存液，在 -20°C 條件下儲(chǔ)藏）。不要將培養(yǎng)液直接加在附著細(xì)胞層上，以免損傷細(xì)胞。

(d)向培養(yǎng)瓶中充入氣體后，放入培養(yǎng)箱。