產品展廳收藏該商鋪

您好 登錄 注冊

當前位置:
上海雅吉生物科技有限公司>技術文章>人毛細血管內皮細胞的分離

技術文章

人毛細血管內皮細胞的分離

閱讀:474          發(fā)布時間:2018-12-19

實驗材料    樣品
試劑、試劑盒    PBS兩性霉素慶大霉素
儀器、耗材    大剪刀刮刀燒瓶鋼篩網離心管層流柜
實驗步驟    
1. 準備下列器械并消毒(高壓滅菌,或者可能的話一次性使用):

大剪刀(兩把)

刮刀(兩或三把)

胰蛋白酶消化的燒瓶(每 30 g 絞碎樣品一個)

帶接液器的 250-μM 鋼篩網

15-ml 和 50-ml 離心管

2. 分離組織樣品。所有操作在層流柜中進行。

(1) 從腹整形樣品分離

① 解剖樣品,去除任何皮膚、筋膜、肌肉等,只保留脂肪組織。稱重樣品,每 10 g 分裝一份。

② 在無菌盤上,用剪刀將樣品剪碎。

③ 用 60 ml 注射器(不帶針頭)吹吸樣品,反復3次或至樣品充分液化。

④ 取 20 ml 組織放入裝有 20 ml PBS 的 50 ml 離心管,混勻,700 r/min 離心 5 分鐘吸出含血水相,重復操作,直至樣品相對無血。

(2) 從吸脂樣品分離

① 置真空包裝樣品于篩網上,用含 0.5 μg/ml 兩性霉素和 200 IU/ml 慶大霉素,200 μg/ml 鏈霉素的 PBS 反復沖洗。沖洗過程中用刮刀在被沖洗物周圍攪動,輔助沖洗。

② 取 20 ml 組織放入裝有 20 ml PBS 的 50 ml 離心管,混勻,700  r/min 離心 5 分鐘。吸掉含血水相。

3. PBS 溶解 BSA 至終濃度 4.0 mg/ml(PBS/BSA);過濾除菌。配制膠原酶溶液,PBS/BSA 溶解膠原酶和 DNA 酶,終濃度分別為 4.0 mg/ml 和 0.02 mg/ml,0.2 μM 濾膜過濾除菌。

10 ml 溶液大約可以處理 10 ml 脂肪樣品。

4. 用無菌刮刀把步驟2中剪碎的脂肪組織刮到胰蛋白酶消化的燒瓶中,然后加入膠原酶,每毫升組織加 1 ml。

5. 37℃ 80 r/min 旋動保溫 30 分鐘。

6. 消化的同時,用 PBS 稀釋 PBS/BSA(4.0 mg/ml BSA)至 BSA 終濃度 0.2 mg/ml。

7. 消化樣品倒入 50 ml 離心管(每管約 20 ml)。

8. 吊筒式醫(yī)用臺式離心機室溫 1500 r/min 離心 5 分鐘。

9. 液態(tài)脂和水相倒入另一 50 ml 離心管。由于細胞沉淀極易被倒掉,使用無菌離心管。

10. 細胞重懸于 5 ml PBS(0.2 mg/ml BSA),1500 r/min 離心 5 分鐘,倒掉上清。沉淀懸于 1 ml 含 5% FCS 的 PBS(PBS/FCS)中。

收藏該商鋪

登錄 后再收藏

提示

您的留言已提交成功!我們將在第一時間回復您~

對比框

產品對比 產品對比 聯(lián)系電話 二維碼 意見反饋 在線交流

掃一掃訪問手機商鋪
021-34661276
在線留言