雞胚胎成肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
試劑、試劑盒    HBSS胰酶溶液膠原溶液
儀器、耗材    解剖顯微鏡不銹鋼深盤Dumom 5 號(hào)鉗子柳葉刀精細(xì)彈簧剪紙巾大燒杯試管架移液管血細(xì)胞計(jì)數(shù)板
實(shí)驗(yàn)步驟    
器材準(zhǔn)備

1. 在培養(yǎng)室實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置下列物品：

解剖顯微鏡

表面和透射照明用的顯微鏡燈泡

裝有 70% 酒精的帶蓋不銹鋼深盤

Dumom 5 號(hào)鉗子，至少兩把

柳葉刀 4 把

精細(xì)彈簧剪一把

洗瓶，內(nèi)裝 75% 酒精

紙巾

盛裝廢棄雞蛋的大燒杯

墊放培養(yǎng)皿的紙巾

100 mm X 20 mm 的培養(yǎng)皿

裝有 Polytowel 的加蓋不銹鋼盤

放大倍數(shù) 100 （物鏡X目鏡）的組合顯微鏡，計(jì)數(shù)細(xì)胞用

2. 在培養(yǎng)室超凈臺(tái)上放置下列物品：

本生燈

可傾斜擺放 15 ml 試管的試管架

盒子，內(nèi)裝：離心管，加有棉花塞的巴斯德吸管，吸球

獨(dú)立包裝的移液管 1 ml、5 ml 和 10 ml

泵

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

Hank 氏平衡鹽溶液（HBSS）及無 Ca2+ 無 Mg2+ 的 HBSS

2.5% 胰酶溶液

2 個(gè)裝有一半體積 HBSS 的 35 mm 規(guī)格的培養(yǎng)皿

25 ml 規(guī)格的燒瓶

(1) 把幾張 lens 紙剪成 2 英寸X2.5 英寸的小長方形，以 Swinny 濾器支持板為模板把一疊濾紙剪成圓片，并在超凈臺(tái)中用洗滌，前后共 2 小時(shí)，換 2~3 次溶液。

(2) 用無水乙醇洗滌 2 小時(shí)，其間換液 2~3 次。

(3) 用蒸餾水洗膜 5~10 遍并浸入水中過夜。

(4) 取一蓋玻片，部分插入水中，用小鉗子把圓紙片拖上蓋玻片，然后紙片朝上放在超凈臺(tái)的紙巾上直至紙片干燥為止。

(5) 將上述小圓紙片連同蓋玻片一同放進(jìn)密閉的培養(yǎng)皿中保存，或用小鉗子小心將小圓紙片揭下單獨(dú)保存。

(6) 裝 Swinney 濾器。按如下順序先裝下半部：墊圈，濾膜支持物，lens 紙片，O 型墊圈及濾器上半部，上下兩部分先松松地?cái)Q在一起。

(7) 在凸出的出料口處插入一支 18# 或更大規(guī)格的針頭。放進(jìn)培養(yǎng)皿中，貼上高壓滅菌帶置 Fast-dry 中高壓滅菌。

(8) 使用：擰緊濾器，安上注射器推進(jìn)桿。

3. 超凈臺(tái)中準(zhǔn)備膠原包被的組織培養(yǎng)平皿

(1) 融化膠原溶液（Life Technologies）：4℃ 過夜或 37℃ 水浴 15 分鐘。

(2) 制作涂布器：煤氣火焰加熱融化巴斯德吸管頭部，在其后 1/2 英寸處加熱直至融化彎成直角，晾涼待用。

(3) 往培養(yǎng)板上滴數(shù)滴膠原液。35 mm 規(guī)格的平板需要 1~2 滴，100 mm 規(guī)格的平板需要 3~4 滴。

(4) 用涂布器把膠原涂布均勻，務(wù)必使邊緣也布滿。

收集和解剖胚胎

4. 用 70% 酒精擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，解剖鏡和燈放在一側(cè)。

5. 鋪紙巾，上放一排培養(yǎng)皿，一個(gè)用以盛放收集到的胚胎，其余的放置開過口的雞蛋。

6. 裝廢棄雞蛋的燒杯也就近擱置。

7. 小心地捏著無菌毛巾的折邊從盒中取出放在計(jì)數(shù)板上，折邊向遠(yuǎn)離你的一邊。捏著毛巾的長邊邊緣小心打開。從酒精中拿出器械，注意尖頭向上，然后尖頭朝折邊放在毛巾上，再重新蓋好。

8. 用 70% 的酒精擦拭或噴淋 11 日齡的雞蛋，然后敲碎，放進(jìn)培養(yǎng)皿中。用鉗子輕輕夾著胚胎頸部，垂直拎出放在另一個(gè)培養(yǎng)皿中。以同樣的方式收集所有的胚胎。若是死胎，全扔掉，包括培養(yǎng)皿。

9. 胚胎移至解剖鏡下，光強(qiáng)度至小的表面光線，用鑷子把胸部皮膚剝離。

10. 用兩把鉗子固定住胚胎，從胸腔肋骨處剪開肌肉，先緊貼并沿著胸骨方向切一口，再一直切到翅膀連接處，肌肉一離開附著點(diǎn)立即收縮，緊貼并沿著胸腔肋骨切一小口一直拉至翅膀連接使肌肉*脫離下來，放進(jìn)裝有 HBSS 溶液的 35 mm 培養(yǎng)皿中，以同樣的方式分離另一半胸肌肉組織。

11. 所有肌肉收集完后，于解剖鏡下檢查。解剖鏡配上比第9步更大功率的透射光源。

12. 清理*部肌肉后，把培養(yǎng)皿放在解剖鏡平臺(tái)上，操兩把解剖刀將肌肉組織切成 1 mm3 見方的塊。巴斯德吸管套上橡皮吸球吸些 HBSS 溶液入培養(yǎng)皿。

13. 挑起組織塊并轉(zhuǎn)移至一燒杯內(nèi)，杯中裝有 10 ml 用 HBSS 溶液配制的 0.25% 胰酶。該酶無鈣和鎂離子。鋁箔包住燒杯口放進(jìn) 37℃ 二氧化碳溫箱中孵育 20~30 分鐘。

胰酶消化細(xì)胞

14. 將上述肌肉組織轉(zhuǎn)移至一離心管中，在醫(yī)用離心機(jī)上中等轉(zhuǎn)速離心 2~3 分鐘使肌肉組織剛好能沉入管底，不要離心太久形成堅(jiān)實(shí)的團(tuán)塊。

15. 小心將胰酶倒入一無菌培養(yǎng)皿中。

16. 離心管中加入 2 ml 肌肉細(xì)胞用培養(yǎng)基（8:1:1）。

17. 先查看一下加棉塞的巴斯德吸管尖頭，保證光滑均勻無裂口，套上吸球吸些許培養(yǎng)基浸潤其內(nèi)壁。然后插到離心管底，輕輕吹打。

18. 加入 3 ml 8:1:1 培養(yǎng)基，稍加吹打讓細(xì)胞分散均勻，然后通過了 lens 濾紙的 Swinney 濾器過濾至一新管中。

計(jì)數(shù)、接種細(xì)胞

19. 計(jì)數(shù)細(xì)胞。

20. 每只 35 mm 規(guī)格的培養(yǎng)皿細(xì)胞接種密度是 3X105 細(xì)胞/ml，共 1.5 ml。大量培養(yǎng)時(shí)，如用 100 mm 規(guī)格的培養(yǎng)皿，通常每只培養(yǎng)皿接種 10 ml 的 5X105 細(xì)胞/ml 的細(xì)胞。

21. 于 37℃，5% CO2 水套式溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞。頭三天，每天更換培養(yǎng)基，以后，隔一天換一次。