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胰島素受體對胰島素親和性的測定實驗
閱讀:455 發(fā)布時間:2018-12-28本實驗介紹胰島素受體對胰島素親和性的測定方法。本實驗來源于蛋白質(zhì)純化與鑒定實驗指南
實驗步驟
材料
[125I]胰島素(受體級)(DuPontNENNEX196)
豬胰島素(如,Sigma Chemical Co,I3505)
牛血淸白蛋白(BSA;1%)
試劑
結(jié)合緩沖液(冷配體置換實驗用)
(配方,見“試劑的配制”,PP.234~240)
操作程序
1)于微量離心管中建立下列反應(yīng)體系:
2)各離心管置搖床上,室溫下孵育2h。
3)各管用微型離心機(jī)離心20min,去上清。
4)用γ-計數(shù)器計數(shù)離心管內(nèi)的放射性強度。分別從第1至6管的cpm值中減去第7管的cpm值(非特異性cpm值和本底cpm值),得特異結(jié)合的cpm值。
5)將各管的特異性結(jié)合cpm值除以總cpm值,得與膜結(jié)合的那部分胰島素所占的份額。該值乘以各管中的胰島素濃度,即得配體-受體復(fù)合物的濃度([HR],亦稱[B],它表示結(jié)合的配體)。
6)從管中的胰島素濃度減去[HR],得游離配體的濃度([H],亦稱[F],它表示游離的配體)。
7)至此,可用幾種方法分析所得的結(jié)果。如能用計算機(jī)程序,將數(shù)據(jù)直接代入下式則更好:
也可通過[HR]對log([H])作圖來分析這些數(shù)據(jù)。此圖應(yīng)給出S型曲線。于是,可分別從[HR]的大值和曲線的拐點得出受體總數(shù)和KD值(Klotz,1982)。第三種方法是用斯卡査德(Scatchard)圖分析數(shù)據(jù),斯卡査德圖就是所作的圖。若只有一種類型的結(jié)合位點,則斯卡査德圖為一直線。為作斯卡査德圖,先要確定對應(yīng)于每個[H]的[HR]/[H]值,然后以[HR]/[H]值對[HR]作圖,此線的斜率為-1/KD,橫坐標(biāo)的截距力受體總數(shù)([R]t)。若有多于一種類型的結(jié)合位點,且有不同的親和性時,斯卡査德圖將是一條曲線而不是直線。