實(shí)驗(yàn)方法原理由于神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cell)具有自我更新和多向分化的潛能，因此，可以采用懸浮神經(jīng)球培養(yǎng)的方法來(lái)獲得和研究。即將胚胎腦組織處理成單個(gè)細(xì)胞后，只有具有自我更新能力的細(xì)胞才能在培養(yǎng)液中克隆增殖成為懸浮的神經(jīng)球，并隨著傳代的進(jìn)行，保持增殖能力和向多種神經(jīng)子代細(xì)胞分化的能力。

實(shí)驗(yàn)材料新生SD大鼠

試劑、試劑盒多聚甲醛蒸餾水PBSDAB血清培養(yǎng)基多聚賴氨酸胎牛血清雙蒸水

儀器、耗材解剖顯微鏡眼科剪吸管24孔培養(yǎng)板制冰機(jī)勻漿器

實(shí)驗(yàn)步驟

 

1.獲得特定腦組織。

 

2.獲取單細(xì)胞懸液通常有兩種方法。機(jī)械分離法操作步驟：

 

①用少量DF12液體覆蓋組織，再用虹膜剪剪碎組織塊成 1 mm3大?。?/p>

 

②將組織塊收集入神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液中；

 

③用fire-polished巴氏吸管吹吸成單細(xì)胞懸液；

 

④細(xì)胞懸液過(guò)200目篩網(wǎng)；

 

⑤離心800r/min,3min,棄上清。

 

胰酶消化＋胰酶抑制劑終止法操作步驟：

 

②用虹膜剪剪碎組織塊成1mm3大?。?/p>

 

②用0.125%胰酶+0.02%EDTA消化組織，37℃-2min;

 

③加入胰酶抑制劑終止消化（使用濃度因生產(chǎn)公司不同、抑制劑活性不同而不同，可參考具體說(shuō)明書）；

 

④800r/min離心3min,棄上清。

 

3.用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，用fire-polished巴氏吸管吹吸成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種，密度為1x105/ml。

 

4.培養(yǎng)3-4d可以1/2量換液，培養(yǎng)7-10d進(jìn)行傳代。程序：切收集神經(jīng)球入離心管，800r/min離心3min;

 

(2)棄上清，加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化組織，37℃孵育3-Smin;

 

＠加入等體積的1X胰酶抑制劑終止消化；

 

＠收集細(xì)胞入離心管中，800r/min離心3min,棄上清；

 

＠加入新的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，用fire-polished巴氏吸管吹吸成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種。

 

5.培養(yǎng)的神經(jīng)球可以接種于多聚賴氨酸包被的皿底或玻片上，加入神經(jīng)干細(xì)胞分化液分化誘導(dǎo)，使其向子代細(xì)胞分化。由于神經(jīng)千細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法實(shí)際上是回顧性的判斷細(xì)胞的身份，即只有能夠持續(xù)傳代增殖并向多種方向分化的細(xì)胞才是真正的神經(jīng)于細(xì)胞，因此，結(jié)果的判讀就要結(jié)合多種方法綜合判斷。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候也需要通過(guò)對(duì)照的設(shè)置來(lái)保證實(shí)驗(yàn)的可信度。具體方法如下：

 

1.形狀：

 

如圖1-8,神經(jīng)干細(xì)胞克隆增殖所獲得的球體一般形狀圓滑，質(zhì)地緊密，細(xì)胞聚集體一般松散而不規(guī)則。

 

2．免疫.細(xì)胞化學(xué)染色：

 

如圖I-9,Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物，可以通過(guò)Nestin免疫熒光染色來(lái)進(jìn)行鑒定。:

 

3.自我更新能力：

 

嚴(yán)格的神經(jīng)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)3-5次傳代來(lái)獲得純度較高的NSC。

 

4.分化潛能：神經(jīng)球分化后可以用神經(jīng)元標(biāo)記物、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(GFAP)、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(PDGFR)等來(lái)進(jìn)行子代細(xì)胞的免疫熒光染色，判斷所得到的細(xì)胞是否具有多向分化潛能。

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注意事項(xiàng)

1.要注意區(qū)分細(xì)胞聚集體和克隆球體，可以根據(jù)上述結(jié)果判讀方法進(jìn)行。

 

2細(xì)胞增殖能力與組織來(lái)源動(dòng)物的年齡以及所取腦區(qū)都有很重要的關(guān)系。胎齡越小干細(xì)胞所處發(fā)育狀態(tài)越幼稚，細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)；皮層來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞相比其他腦區(qū)更容易獲得增殖能力較好的細(xì)胞。

 

3.腦膜組織對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞有誘導(dǎo)貼壁和分化的作用，所以，組織處理過(guò)程中一定要清除干凈腦膜組織等。

 

4血清對(duì)千神經(jīng)干細(xì)胞有誘導(dǎo)分化的作用，所以終止消化時(shí)不能使用加有血清的培養(yǎng)液。

 

5傳代的時(shí)間一般為7-10d左右，但是如果神經(jīng)球的體積較大，光鏡下觀察其中心已經(jīng)開始出現(xiàn)黑色區(qū)域（產(chǎn)生黑色區(qū)域的原因可能是因?yàn)榍蝮w體積過(guò)大，影響光線透過(guò)，但是此時(shí)球體中心也往往會(huì)出現(xiàn)死細(xì)胞），則要及時(shí)傳代。

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其他

1.機(jī)械法分離獲得的細(xì)胞容易有細(xì)胞聚集，培養(yǎng)得來(lái)的球體就有可能不是單細(xì)胞克隆體；而消化法的消化液濃度和時(shí)間則要根據(jù)組織來(lái)源動(dòng)物的不同年齡以及組織來(lái)源的不同區(qū)域進(jìn)行調(diào)整，摸索消化濃度和時(shí)間。

 

2.由于神經(jīng)干細(xì)胞貼壁后也具有一定的促使分化的作用，所以，培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的皿或瓶用新的無(wú)劃痕的器皿。

 

3如果觀察到培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，可以通過(guò)更換培養(yǎng)瓶的方法來(lái)進(jìn)行挽救，并且發(fā)現(xiàn)后越早更換越好。但是如果球體還沒(méi)有形成，則盡量不要更換器皿和觸碰細(xì)胞，否則會(huì)影響神經(jīng)球的形成。