實(shí)驗(yàn)方法原理將小鼠的肝細(xì)胞從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。

實(shí)驗(yàn)材料SD大鼠

試劑、試劑盒小牛血清DMEM酶消化液D-Hanks' 液酚紅臺(tái)盼蘭HBSS氯化鈉PBS

儀器、耗材手術(shù)刀手術(shù)剪尼龍網(wǎng)相差顯微鏡熒光顯微鏡

實(shí)驗(yàn)步驟

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

 

1.  動(dòng)物：雄性SD大鼠(體重250-450 g)。

 

2.   試劑：，小牛血清(或胎牛血清，則更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚紅 0.02 g/L)，HBSS，臺(tái)盼蘭等。

 

3.  器械：手術(shù)器械，200目尼龍網(wǎng)，相差顯微鏡，熒光顯微鏡。

 

二、原代培養(yǎng)方法

 

1.  大鼠腹腔麻醉后在超凈臺(tái)上剖腹，進(jìn)行門靜脈插管，以D-Hanks'液灌注，同時(shí)剪開(kāi)下腔靜脈，沖掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型膠原酶)。

 

2.  待肝臟變軟后，離體肝臟并剪碎，繼續(xù)以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型膠原酶)消化15 min，尼龍網(wǎng)過(guò)濾后以450 g 離心5 min(4℃，下同)。

 

3.  以HBSS重懸沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS，1450 g離心16 min后取界面細(xì)胞。

 

4.  以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞，以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并判斷存活率和產(chǎn)量，后按照常規(guī)方法接種(105細(xì)胞/cm2)，次日換液，以后每2-3天換液一次。

 

三、傳代方法

 

棄去培液后以D-Hanks'液洗兩次，加0.125%胰酶(原代加0.05% EDTA)消化，鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右)，以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA，可以不需離心)，充分吹打后以1:2-1:3接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)(5%CO2，37℃)。

 

四、 結(jié)果

接種次日，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈星芒狀，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴，熒光鏡下328 nm處見(jiàn)自發(fā)熒光。附上發(fā)表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(圖1)。

注意事項(xiàng)

1.  進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和α-SMA；后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。

 

2.  采用無(wú)須原位消化的方案，*可行，只不過(guò)消化時(shí)間更難控制！實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的或傳代后9代內(nèi)的細(xì)胞(5代以內(nèi))。

其他

一、參考文獻(xiàn)

 

1. 袁桃霞，張錦生，張?jiān)露?，? 大鼠肝Ito細(xì)胞的體外培養(yǎng)及肝素對(duì)其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 1996;23(2):90-93.

 

2. Huang GC, Zhang JS, Tang QQ. Involvement of C/EBP-α gene in in vitro activation of rat hepatic stellate cells. Biochem Biophys Res Commun 2004;324(4):1309-1318.