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125I-UdR釋放試驗測定NK細胞活性
閱讀:988 發(fā)布時間:2019-2-25實驗方法原理 25I-UdR(125I-2′脫氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶核苷的類似物,作為DNA合成的前體物,能相當(dāng)特異地取代胸腺嘧啶核苷摻入到細胞核DNA鏈上。因此,可用125I-UdR標記體外傳代培養(yǎng)的腫瘤細胞作為靶細胞,以外周血分離的單個核細胞或小鼠脾細胞作為效應(yīng)細胞,進行體外NK細胞活性檢測。被效應(yīng)細胞殺傷的靶細胞溶解后可釋放125 I-UdR,用γ-計數(shù)儀測定其放射性強度,以125I-UdR釋放百分率表示NK細胞的活性。
實驗材料 YAC-1細胞
試劑、試劑盒 125I-UdR(125I-2′脫氧尿嘧啶核苷)胰蛋白酶DNA酶5-氟脫氧尿嘧啶核苷RPMI-1640培養(yǎng)液
儀器、耗材 塑料試管γ-計數(shù)儀離心機
實驗步驟
一、材料
1. 125I-UdR :125I的物理半壽期為59.7d。
2. 胰蛋白酶:用無Ca2+、Mg2+的Hanks液配制成3mg/ml,小量分裝,-20℃凍存。
3. DNA酶:用Hanks液配成50μg/ml,小量分裝,-20℃凍存。
4. 5-氟脫氧尿嘧啶核苷(5-FudR)用生理鹽水配制成1×10-3 mol/L,4℃冰箱保存。
5. 其余材料同上。
二、操作方法
1. 靶細胞的制備:取培養(yǎng)24~48h的靶細胞1ml(5×105 /ml),分別加入5-FudR 4~6μl和125I-UdR 6μCi,混勻,置37℃培養(yǎng)2h,取出后用含5%NCS的1640營養(yǎng)液洗滌3次,每次離心1500r/min,2min,后用*RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮,計數(shù)活細胞。用γ-計數(shù)儀檢測標記率,一般可達1~2cpm/細胞即可;
2. 效應(yīng)細胞的制備:用常規(guī)方法分離PBMC或小鼠脾細胞,后用*RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮并計數(shù);
3. 效-靶細胞作用:調(diào)整效應(yīng)細胞和標記的靶細胞濃度,分別加入塑料試管中,效/靶細胞比例為100:1。同時設(shè)只加標記靶細胞的自然釋放對照管,每份標本和對照管均設(shè)3個復(fù)管,每管均用*RPMI-1640培養(yǎng)液補足體積至1ml,混勻,離心1500r/min,2min,以促進效-靶細胞作用,置37℃,5%CO2溫箱中培養(yǎng)18h。
4. 酶處理:取出效/靶細胞培養(yǎng)物,1500r/min離心2min,棄上清,于每管中加入胰蛋白酶和DNA酶各0.1ml,混勻后置37℃水浴30min,促使已受損傷的靶細胞釋放125I-UdR,然后于各管中加入0.8ml冷Hanks液,以終止酶反應(yīng)。1500r/min離心2min,分別吸出各管上清0.5ml置于另一個塑料試管中。
5. 放射性測量和結(jié)果計算:用γ-計數(shù)儀分別測量每管上清和細胞部分的cpm值,并按下式計算125I-UdR釋放率和NK細胞活性,取三管均值作為NK細胞活性。
125 I-UdR釋放率(%)= (0.5ml上清cpm值×2)/(0.5ml上清cpm值+0.5ml細胞懸液cpm值)×100%
NK細胞活性(%) =試驗管125 I-UdR釋放率 - 對照管125 I-UdR自然釋放率。
一般要求125I-UdR自然釋放率<10%,檢測小鼠脾細胞NK活性用YAC-1細胞作為靶細胞時,檢測前可不經(jīng)過酶處理。
收起
注意事項
1. 該標記法需要長時間的孵育,用酶處理可增加方法的敏感性。
2. 要獲得較理想的結(jié)果,關(guān)鍵在于對靶細胞標記前的代傳處理。使細胞處于對數(shù)增長期的活力狀態(tài),以達到適的標記率和增強細胞對放射性同位素毒性作用的抗力,從而降低自然釋放。
3. 因為如果發(fā)生污染就要丟棄培養(yǎng)的細胞,重新開始。
其他
1. NK活性計算:
同位素釋放%(NK活性)=(實驗組cpm一自然釋放cpm)/(大釋放cpm一自然釋放cpm)X100
自然釋放%=(自然釋放cpm/大釋放cpm)x100
此結(jié)果中列出的同位素釋放%,即代表NK活性。
2. 目前常用鉻酸鈉(Na51cro4)及125I一脫氧尿嘧啶核苷(125I-UdR)標記祛,兩種方祛各有利弊。
51Cr優(yōu)點:敏感、簡便、流程短、重復(fù)性好,缺點為半衰期短、自然釋放高。
125I-UdR優(yōu)點:半衰期長、自然釋放低、適于孵育時間較長的實驗。缺點為敏感性較低、流程長。