實(shí)驗(yàn)方法原理    25I-UdR（125I-2′脫氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶核苷的類似物，作為DNA合成的前體物，能相當(dāng)特異地取代胸腺嘧啶核苷摻入到細(xì)胞核DNA鏈上。因此，可用125I-UdR標(biāo)記體外傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以外周血分離的單個(gè)核細(xì)胞或小鼠脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行體外NK細(xì)胞活性檢測(cè)。被效應(yīng)細(xì)胞殺傷的靶細(xì)胞溶解后可釋放125 I-UdR，用γ-計(jì)數(shù)儀測(cè)定其放射性強(qiáng)度，以125I-UdR釋放百分率表示NK細(xì)胞的活性。
實(shí)驗(yàn)材料    YAC-1細(xì)胞
試劑、試劑盒    125I-UdR（125I-2′脫氧尿嘧啶核苷）胰蛋白酶DNA酶5-氟脫氧尿嘧啶核苷RPMI-1640培養(yǎng)液
儀器、耗材    塑料試管γ-計(jì)數(shù)儀離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、材料

1. 125I-UdR ：125I的物理半壽期為59.7d。

2. 胰蛋白酶：用無Ca2+、Mg2+的Hanks液配制成3mg/ml，小量分裝，-20℃凍存。

3. DNA酶：用Hanks液配成50μg/ml，小量分裝，-20℃凍存。

4. 5-氟脫氧尿嘧啶核苷（5-FudR）用生理鹽水配制成1×10-3 mol/L，4℃冰箱保存。

5. 其余材料同上。

二、操作方法

1. 靶細(xì)胞的制備：取培養(yǎng)24～48h的靶細(xì)胞1ml（5×105 /ml），分別加入5-FudR 4～6μl和125I-UdR 6μCi，混勻，置37℃培養(yǎng)2h，取出后用含5%NCS的1640營(yíng)養(yǎng)液洗滌3次，每次離心1500r/min，2min，后用*RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮，計(jì)數(shù)活細(xì)胞。用γ-計(jì)數(shù)儀檢測(cè)標(biāo)記率，一般可達(dá)1～2cpm/細(xì)胞即可；

2. 效應(yīng)細(xì)胞的制備：用常規(guī)方法分離PBMC或小鼠脾細(xì)胞，后用*RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮并計(jì)數(shù)；

3. 效-靶細(xì)胞作用：調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞和標(biāo)記的靶細(xì)胞濃度，分別加入塑料試管中，效/靶細(xì)胞比例為100:1。同時(shí)設(shè)只加標(biāo)記靶細(xì)胞的自然釋放對(duì)照管，每份標(biāo)本和對(duì)照管均設(shè)3個(gè)復(fù)管，每管均用*RPMI-1640培養(yǎng)液補(bǔ)足體積至1ml，混勻，離心1500r/min，2min，以促進(jìn)效-靶細(xì)胞作用，置37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)18h。

4. 酶處理：取出效/靶細(xì)胞培養(yǎng)物，1500r/min離心2min，棄上清，于每管中加入胰蛋白酶和DNA酶各0.1ml，混勻后置37℃水浴30min，促使已受損傷的靶細(xì)胞釋放125I-UdR，然后于各管中加入0.8ml冷Hanks液，以終止酶反應(yīng)。1500r/min離心2min，分別吸出各管上清0.5ml置于另一個(gè)塑料試管中。

5. 放射性測(cè)量和結(jié)果計(jì)算：用γ-計(jì)數(shù)儀分別測(cè)量每管上清和細(xì)胞部分的cpm值，并按下式計(jì)算125I-UdR釋放率和NK細(xì)胞活性，取三管均值作為NK細(xì)胞活性。

125 I-UdR釋放率（%）= （0.5ml上清cpm值×2）/（0.5ml上清cpm值+0.5ml細(xì)胞懸液cpm值）×100％

NK細(xì)胞活性（%） =試驗(yàn)管125 I-UdR釋放率 - 對(duì)照管125 I-UdR自然釋放率。

一般要求125I-UdR自然釋放率<10％，檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞NK活性用YAC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，檢測(cè)前可不經(jīng)過酶處理。
收起 
注意事項(xiàng)    
1. 該標(biāo)記法需要長(zhǎng)時(shí)間的孵育，用酶處理可增加方法的敏感性。

2. 要獲得較理想的結(jié)果，關(guān)鍵在于對(duì)靶細(xì)胞標(biāo)記前的代傳處理。使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的活力狀態(tài)，以達(dá)到適的標(biāo)記率和增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放射性同位素毒性作用的抗力，從而降低自然釋放。

3. 因?yàn)槿绻l(fā)生污染就要丟棄培養(yǎng)的細(xì)胞，重新開始。
其他    
1. NK活性計(jì)算：

同位素釋放%（NK活性）=（實(shí)驗(yàn)組cpm一自然釋放cpm）/（大釋放cpm一自然釋放cpm）X100

自然釋放%=（自然釋放cpm/大釋放cpm）x100

此結(jié)果中列出的同位素釋放%,即代表NK活性。

2. 目前常用鉻酸鈉（Na51cro4）及125I一脫氧尿嘧啶核苷（125I-UdR）標(biāo)記祛，兩種方祛各有利弊。

51Cr優(yōu)點(diǎn)：敏感、簡(jiǎn)便、流程短、重復(fù)性好，缺點(diǎn)為半衰期短、自然釋放高。

125I-UdR優(yōu)點(diǎn)：半衰期長(zhǎng)、自然釋放低、適于孵育時(shí)間較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)為敏感性較低、流程長(zhǎng)。